MTT法測定甲殼低聚糖對腸道微生物生長的影響

李 娜，肖凱軍，龐 浩，王兆梅,*

(1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640；2.中國科學(xué)院 廣州化學(xué)研究所纖維素化學(xué)重點實驗室，廣東 廣州 510650)

MTT法測定甲殼低聚糖對腸道微生物生長的影響

李 娜1，肖凱軍1，龐 浩2，王兆梅1,*

(1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640；2.中國科學(xué)院 廣州化學(xué)研究所纖維素化學(xué)重點實驗室，廣東 廣州 510650)

以腸道益生菌(保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌)和腸道腐敗菌(金黃色葡萄球菌、沙門氏菌)為研究對象，通過用MTT法來考察甲殼低聚糖對腸道微生物生長的影響。結(jié)果表明：在一定質(zhì)量濃度(0.1～0.8g/100mL)范圍內(nèi)，甲殼低聚糖對腸道益生菌保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌均有明顯的增殖作用；隨著菌體培養(yǎng)基糖(甲殼低聚糖)質(zhì)量濃度的增大，甲殼低聚糖對腸道腐敗菌金黃色葡萄球菌、沙門氏菌抑制效果增強；同時分子質(zhì)量1kD的甲殼低聚糖比分子質(zhì)量3kD的對微生物生長的影響更為顯著。

MTT法；甲殼低聚糖；腸道微生物

甲殼低聚糖(chitosan oligosaccharide，COS)是甲殼素經(jīng)脫乙?；徒到馍傻囊活惖途酆隙?、可溶于水的氨基糖類化合物[1]，因其具有良好的水溶性、保濕型、抑菌抗菌等生物學(xué)活性從而被廣泛應(yīng)用于化妝品、食品及醫(yī)藥方面[2-3]。而這些生物活性的強弱與COS的分子質(zhì)量和脫乙酰度大小有關(guān)[4-6]。彭益強等[7]研究發(fā)現(xiàn)在一定的分子質(zhì)量范圍內(nèi)，隨著分子質(zhì)量和殼聚糖質(zhì)量濃度的增加，殼聚糖對金黃色葡萄球菌，短小芽孢桿菌等陽性菌的抗菌作用效果增強。對大腸桿菌等陰性菌來說，殼聚糖還受到細菌表面性質(zhì)影響，細菌親水性越好，所帶的負電荷越多，殼聚糖表現(xiàn)抑菌性能越好[8]。

在對低聚殼聚糖進行抑菌實驗的過程中，細菌計數(shù)方法的選擇至關(guān)重要。傳統(tǒng)的計數(shù)方法有血球板計數(shù)法、濁度法、菌體干質(zhì)量法、平板稀釋法等，而平板稀釋法過程繁瑣、耗時長、重復(fù)性差，不能及時反映菌體生長情況，而其他幾種方法不能區(qū)分細胞死活。而近年來發(fā)展起來的四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法具有簡單、快速、靈敏、穩(wěn)定等特點被用于生物細胞的活性檢測[9-11]。本實驗選擇兩種腸道益生菌(保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌)和兩種腸道腐敗菌(金黃色葡萄球菌、沙門氏菌)，采用MTT法檢測甲殼低聚糖和低聚果糖對其生長活性的影響，為低聚糖和益生菌臨床配伍使用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

保加利亞乳桿菌(Lactobecillus bulgaricus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcu themophilus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙門氏菌(Salmonella)，由廣東微生物種質(zhì)資源庫提供。

保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌用固體MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)，金黃色葡萄球菌和沙門氏菌用固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器

甲殼低聚糖(脫乙酰度為72%，分子質(zhì)量分別為1kD (COS1)和3kD(COS2))為粵式食品 實驗室自制；低聚果糖(FOS，含量55%) 新金山生物科技有限公司；噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO) 美國Sigma公司。

XSP-3CA型單目生物顯微鏡 日本Olympus公司；DG5032型酶聯(lián)免疫檢測儀 南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司；UV-2102PC型紫外-可見分光光度計 上海Unico公司；PYX-250G-B型光照培養(yǎng)箱 廣東韶關(guān)科力實驗儀器有限公司；LS-B35L-I型高壓滅菌鍋 廣州永程實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1MTT比色實驗[12-13]

將活化的細菌溶于滅菌的PBS溶液(pH7.0)[14]，并倍比稀釋成20～27共8個梯度，分別對不同濃度的菌液做MTT比色實驗，同時做平板菌落計數(shù)。

用微量吸液器吸取不同濃度的菌液100μL，分別加入96孔酶標板中，每個濃度的樣液做5個復(fù)孔，分別加入MTT溶液，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，20min后取出，向各孔分別加入一定量的DMSO，用全自動酶標儀于最大吸收波長570nm處測定OD值，測量前振動60s。

1.3.2 培養(yǎng)基糖質(zhì)量濃度與菌株活菌數(shù)相關(guān)性的建立

用MTT法測定不同濃度菌液的光密度值(OD570nm)，以不同濃度菌液的OD570nm(X)為橫坐標，菌液濃度(Y)為縱坐標作圖，得出不同菌株的OD570nm值-菌液濃度曲線及相關(guān)系數(shù)。同時采用平板菌落計數(shù)[12]測定糖甲殼低聚不同質(zhì)量濃度條件下的活菌數(shù)，間接得出OD570nm值與菌株活菌數(shù)的曲線，從而得出不同分子質(zhì)量的甲殼低聚糖對腸道益生菌和腐敗菌生長的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 最優(yōu)MTT法的建立

MTT法能夠快速測定活菌數(shù)目，但是由于其精確度與細菌種類、細菌的生長狀態(tài)及其代謝產(chǎn)物有關(guān)[15-16]，因此為了達到較高的精確度，必須針對實驗條件下的菌種建立最優(yōu)的MTT法。通過對各種加入試劑的OD值測定得到表1。

表1 各種干擾試劑條件下的OD570nm值Table 1 Absorbance at 570 nm in the presence of various interference factors

由表1可知，各種液體介質(zhì)都會對OD570nm值的測量結(jié)果造成干擾。其中菌體本身的干擾程度最大，菌體濃度過高，將導(dǎo)致誤差的增大。

以滅活后的待測菌液代替活菌液為空白對照，待測菌液各100μL，以MTT溶液10μL或20μL和是否添加DMSO設(shè)置4種反應(yīng)條件。經(jīng)過測定4種菌分別在4種反應(yīng)條件下的OD570nm值與菌液濃度曲線的參數(shù)(R2)，得出最佳的實驗方案，結(jié)果見表2。

表2 不同菌種的最佳實驗方案Table 2 Optimal experimental designs for different strains

通過對稀釋度為27的菌液做平板菌落計數(shù)，得到該濃度菌液所含的細菌濃度。結(jié)合表2得出不同菌種在最佳方案下，各個稀釋度菌液對應(yīng)的OD570nm值和菌液濃度。對OD570nm值-菌液濃度繪制曲線，可得各個細菌的工作曲線及菌液濃度測量范圍及相關(guān)系數(shù)如表3。

表3 不同菌種的工作曲線方程Table 3 Working curves for different strains

由表3可知，在一定菌液濃度范圍內(nèi)，OD570nm值和菌液細菌濃度呈現(xiàn)良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)可以達到0.99以上，在該濃度范圍內(nèi)可以保證結(jié)果具有較高的精確度。

2.2 甲殼低聚糖對腸道益生菌生長的影響

2.2.1 甲殼低聚糖對保加利亞乳桿菌體外生長的影響

以低聚果糖作陽性對照，同時以質(zhì)量濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/100mL的不同分子質(zhì)量的甲殼低聚糖(COS1和COS2)為碳源，用MTT法測定OD570nm值進而得到低聚果糖質(zhì)量濃度與活菌數(shù)量的關(guān)系曲線，如圖1所示。

圖1 培養(yǎng)基糖質(zhì)量濃度對保加利亞乳桿菌生長的影響Fig.1 Effect of oligo-chitosan on the growth of Lactobecillus bulgaricus

由圖1可知，在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，低聚果糖、COS1和COS2對保加利亞乳桿菌都有增殖作用，隨著質(zhì)量濃度的增大，增殖作用越顯著。低聚果糖的最佳增殖質(zhì)量濃度為0.8g/100mL，但COS2增殖作用沒有低聚果糖顯著。對COS1而言，在質(zhì)量濃度為0.2g/100mL條件下達到了最佳的增殖效果，且在該質(zhì)量濃度下增殖作用超過了COS2，略低于低聚果糖。隨著COS1質(zhì)量濃度的增加，增殖效果開始減弱，當(dāng)質(zhì)量濃度達到0.7g/100mL左右，相對增殖作用近似于0，質(zhì)量濃度超過這一點后，則表現(xiàn)出對微生物生長的抑制作用，可能是因為高質(zhì)量濃度的低聚糖在培養(yǎng)基中形成了高的滲透壓，對細菌產(chǎn)生了一定的脫水作用，抑制了其生長，質(zhì)量濃度過低促進作用又不明顯[17]。

2.2.2 甲殼低聚糖對嗜熱乳酸鏈球菌體外生長的影響

圖2 培養(yǎng)基糖質(zhì)量濃度對嗜熱乳酸鏈球菌生長的影響Fig.2 Effect of oligo-chitosan on the growth of Streptococcu themophilus

由圖2可知，低聚果糖在0～1.0g/100mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對嗜熱乳酸鏈球菌都具有明顯的增殖作用，增殖作用隨著低聚果糖的質(zhì)量濃度增加而增加。COS1在0～0.6g/100mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對嗜熱乳酸鏈球菌有一定的增殖作用，但增殖作用不顯著。相對COS1而言，COS2在低質(zhì)量濃度0～0.4g/100mL之間，對嗜熱乳酸鏈球菌有明顯的增殖作用，其效果優(yōu)于其他兩種糖類，其最佳增殖質(zhì)量濃度為0.4g/100mL。當(dāng)質(zhì)量濃度超過0.6g/100mL后，微生物已經(jīng)無法完全利用甲殼低聚糖，過量的殼聚糖給細菌的生長帶來阻礙，抑制了細菌的增殖，細菌數(shù)量銳減，低于無糖對照組。增殖作用機理可能與其氨基葡萄糖聚合物的性質(zhì)有關(guān)，或者與其易溶于弱酸的特性有關(guān)。殼聚糖在酸性環(huán)境中溶解形成膠體[18]，這種膠體性質(zhì)促進了雙歧桿菌、乳酸桿菌的繁殖，但其確切的作用機理，還有待進一步研究。

2.3 甲殼低聚糖對腸道腐敗菌生長的影響

2.3.1 甲殼低聚糖對金黃色葡萄球菌生長的影響

圖3 培養(yǎng)基糖質(zhì)量濃度對金黃色葡萄球菌生長的影響Fig.3 Effect of oligo-chitosan on the growth of Staphylococcus aureus

由圖3可知，低聚果糖與甲殼低聚糖對金黃色葡萄球菌的生長影響呈現(xiàn)出兩個極端。低聚果糖對金黃色葡萄球菌有顯著的增殖作用，隨著質(zhì)量濃度的增加而不斷加強。與此同時，COS1與COS2對金黃色葡萄球菌都表現(xiàn)強烈的抑制作用。兩條曲線近乎重疊，0～0.4g/100mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，活菌數(shù)量急劇下降，質(zhì)量濃度超過0.4g/100mL后，活細菌的數(shù)量已經(jīng)很少，培養(yǎng)基中已經(jīng)基本不生長細菌。由于金黃色葡萄球菌屬于革蘭氏陽性菌，細胞壁含有豐富的磷壁酸，殼聚糖不能通過靜電作用吸附到細菌表面，因此，殼聚糖主要通過表面滲透進入細胞內(nèi)，吸附細胞體內(nèi)帶有陰離子的細胞質(zhì)，并發(fā)生絮凝作用，擾亂細胞正常的生理活動，導(dǎo)致殼聚糖誘導(dǎo)達到細菌細胞組分泄漏，從而抑制細菌生長[19]。

2.3.2 甲殼低聚糖對沙門氏菌生長的影響

由圖4可知，低聚果糖對沙門氏菌有顯著增殖的作用，曲線呈現(xiàn)上升趨勢。兩種甲殼低聚糖對沙門氏菌呈現(xiàn)抑制作用，其中COS1對沙門氏菌的抑菌作用顯著高于COS2。沙門氏菌屬于革蘭氏陰性菌，細菌細胞壁排列比較疏散，因此殼聚糖分子進入細菌細胞內(nèi)與細菌DNA結(jié)合, 干擾DNA結(jié)構(gòu)，從而抑制細菌生長。殼聚糖分子質(zhì)量越小，越容易進入細菌細胞內(nèi)，所以抑菌效果隨殼聚糖分子質(zhì)量降低而增強[8]。

圖4 培養(yǎng)基糖質(zhì)量濃度對沙門氏菌生長的影響Fig.4 Effect of oligo-chitosan on the growth of Salmonella

3 結(jié) 論

本實驗研究了兩種不同分子質(zhì)量的甲殼低聚糖(COS1和COS2)對腸道微生物體外益生菌和腐敗菌生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(0.1～0.8g/100mL)，COS1和COS2促進保加利亞乳桿菌和嗜熱乳酸鏈球菌的生長。COS1和COS2對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌都有較好的抑菌作用，抑菌作用隨著質(zhì)量濃度的增大而增強。同時低分子質(zhì)量的甲殼低聚糖COS1對微生物生長的影響更為顯著。與低聚果糖不同，甲殼低聚糖對微生物的生長具有選擇性，即促進益生菌增殖、抑制腐敗菌生長，為益生菌產(chǎn)品研發(fā)提供一定的參考價值，也為研究開發(fā)合生元產(chǎn)品提供技術(shù)支持。

[1]ENEL S, McCLURE S J. Potential applications of chitosan in veterinary medicine[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2004, 56(10): 1467-1480.

[2]王軍, 周本權(quán), 楊許召, 等. 低聚殼聚糖的制備及應(yīng)用研究進展[J].日用化學(xué)工業(yè), 2010, 40(2): 124-127.

[3]MADY M M, DARWISH M M. Effect of chitosan coating on the characteristics of DPPC liposomes[J]. Journal of Advanced Research, 2010, 1(3): 187-191.

[4]SINGLA A K, CHAWLA M. Chitosan: some pharmaceutical and biological aspects: an update[J]. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2001, 53(8): 1047-1067.

[5]HUANG M, KHOR E, LIM L Y. Uptake and cytotoxicity of chitosan molecules and nanoparticles: effects of molecular weight and degree of deacetylation[J]. Pharmaceutical Research, 2004, 21(2): 344-353.

[6]邵榮, 許琦, 余曉紅, 等. 殼聚糖抗菌性能的研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(9): 121-124.

[7]彭益強, 朱麗萍, 劉雯, 等. 可溶性低聚殼聚糖的制備與抗菌性能研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(2): 98-101.

[8]李小芳, 馮小強, 楊聲. 殼聚糖對革蘭氏陰性菌抑菌機理的初步研究[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(13): 148-153.

[9]楊翠云, 劉永定. MTT方法評價微生物細胞活性的探討[J]. 水生生物學(xué)報, 2009, 33(4): 577-580.

[10]ARSECULERATNE S N, ATAPATTU D N. The assessment of the viability of the endospores of Rhinosporidium seeberi with MTT (3-[4, 5-dimethyl-2-thiazolyl]-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)[J]. The British Mycological Society, 2004, 108(12): 1423-1430.

[11]王忠朝, 范麗苑, 蔡煒. MTT法用于檢測伴放線菌嗜血菌的研究[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生, 2010, 26(8): 1121-1123.

[12]魏鴻剛, 李元, 劉健. 一種快速的活菌計數(shù)新方法研究[J]. 微生物學(xué)通報, 2002, 29(2): 89-92.

[13]王栩, 鄔于川, 夏世平, 等. MTT法進行活菌計數(shù)的方法學(xué)探討[J].瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2002, 25(4): 291-293.

[14]黃立坤, 杜鵬, 霍貴成. MTT法測定乳酸菌活菌數(shù)的研究[J]. 食品工業(yè), 2008(3): 62-65.

[15]趙承彥, 靖志安, 牛青霞. MTT顯色反應(yīng)實驗條件分析[J]. 河南醫(yī)學(xué)研究, 2000, 9(2): 107-116.

[16]YOUNG F M, PHUNGTAMDET W, SANDERSON B J S. Modification of MTT assay conditions to examine the cytotoxic effects of amitraz on the human lymphoblastoid cell line, WIL2NS[J]. Toxicology in Vitro, 2005, 19(8): 1051-1059.

[17]萬榮峰, 王麗平, 江善祥. 兩種低聚糖對乳酸菌體外增殖的影響[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2007, 11(19): 3768-3770.

[18]LEE H W, PARK Y S, JUNG J S, et al. Chitosan oligosaccharides, dp 2-8, have prebiotic effect on the Bifidobacterium bifidium and Lactobacillus sp.[J]. Food Microbiology, 2003, 8(6): 319-324.

[19]陳威, 吳清平, 張菊梅. 殼聚糖抑菌機制的初步研究[J]. 微生物學(xué)報, 2008, 48(2): 164-168.

Effect of Oligo-chitosan on the Growth of Intestinal Microorganisms as Determined by MTT Assay

LI Na1，XIAO Kai-jun1，PANG Hao2，WANG Zhao-mei1,*
(1. College of Light Industry and Food Science, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China；2. Key Laboratory of Cellulose and Lignocellulosics Chemistry, Guangzhou Institute of Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China)

The effect of oligo-chitosan on the growth of intestinal microorganisms was studied using MTT assays. The results indicated that oligo-chitosan could obviously accelerate the proliferation of Lactobecillus bulgaricus and Streptococcu themophilus at the concentration range of 0.1ˉ0.8 g/100 mL, while the antibacterial activity of oligo-chitosan against Staphylococcus aureus and Salmonella was strengthened with increasing oligo-chitosan concentration. The oligo-chitosan with molecular weight of 1 kD revealed more obvious impact on the growth of intestinal microorganisms than the oligo-chitosan with molecular weight of 3 kD. Key words：MTT assay；oligo-chitosan；intestinal microorganisms

TS252.1

A

1002-6630(2012)03-0101-04

2011-03-17

國家自然科學(xué)基金項目(31071505)；華南理工大學(xué)中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項(2009ZM0187)；華南理工大學(xué)廣東省大學(xué)生創(chuàng)新實驗項目(S1010561061)

李娜(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為糖質(zhì)資源分離純化及應(yīng)用。E-mail：linadream1986@163.com

*通信作者：王兆梅(1974—)，女，副教授，博士，研究方向為天然多糖生物活性及應(yīng)用。E-mail：wangzm@scut.edu.cn