浦東地區(qū)部分養(yǎng)豬場常見病原菌的分離與鑒定

俞向前，賈 銳，劉耀方，顧武軍，龔大弟，范德忠，朱建國，葉承榮＊

（1.上海市浦東新區(qū)動物疫病預防控制中心，上海 201299；2.上海交通大學，上海 200240；3.上海市浦東新區(qū)農(nóng)業(yè)服務中心，上海 201201）

近年來，隨著浦東新區(qū)養(yǎng)殖業(yè)格局的調(diào)整，規(guī)?；?、集約化養(yǎng)豬場疫病流行出現(xiàn)了一些新的變化。某些地區(qū)的規(guī)模豬場一定程度地存在著豬只發(fā)育遲緩、體弱、發(fā)病乃至死亡，直接導致較高的死淘率。這些發(fā)育遲緩、體弱和發(fā)病的豬只，不但影響豬場正常生產(chǎn)，而且增加了養(yǎng)殖成本，嚴重困擾著當?shù)仞B(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，也給食品衛(wèi)生和人的健康造成隱患。當?shù)丶夹g部門通過長期系統(tǒng)的調(diào)查研究后認為，造成死淘率偏高的原因是多方面的，其中以疫病流行為主要原因，因此，采取包括豬群疫病防控技術在內(nèi)的、旨在降低生豬死淘率的綜合技術體系，是今后一段時間內(nèi)我國養(yǎng)豬業(yè)面臨的緊迫課題之一。

本研究針對浦東地區(qū)重點豬場主要疫病發(fā)病特點，對一些重要致病菌如沙門菌、巴氏桿菌、鏈球菌等本地帶菌狀況進行調(diào)查分析，以期獲得豬場疫病流行病學數(shù)據(jù)，制定合理的防治方案。

1 材料與方法

1.1 材料

TaqDNA聚合酶、DNA Marker、pMD－18－T載體和DNA凝膠回收試劑盒，PCR Mix試劑、E.coliDH5α、氨芐青霉素（Amp），寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；生化反應試劑盒，北京陸橋技術有限責任公司產(chǎn)品；培養(yǎng)及原料瓊脂、蛋白胨、酵母膏，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；TSA （Tryptic soy agar）、麥康凱（MC ）瓊脂、THB肉湯（Todd He－witt）以及50mL／L綿羊血瓊脂平板，上海凌峰化學試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離 考慮到目前養(yǎng)豬場普遍存在多種病原菌混合感染的情況，本試驗選擇養(yǎng)豬場常見的沙門菌、多殺性巴氏桿菌以及鏈球菌為重點分離目標菌。對現(xiàn)場剖檢病豬無菌采集豬只肺臟、肝臟、心血、大腦、關節(jié)液、腸管、脾臟和淋巴結等作為接種病料，分別選擇3種病原菌的培養(yǎng)基當場直接劃線，送實驗室進行培養(yǎng)。針對沙門菌疑似病料，參照文獻［1］的方法，將病料接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，置于37℃培養(yǎng)24h，然后從平板上挑取單個可疑菌落接種于麥康凱瓊脂平板上，于37℃培養(yǎng)24h，對可疑菌落進行涂片，革蘭染色后鏡檢；針對多殺性巴氏桿菌，按照文獻［2］的方法，將病料接種于TSA培養(yǎng)基，置于37C培養(yǎng)過夜，挑取可疑菌落進行瑞染色鏡檢；對于鏈球菌，按照文獻［3］的方法，將病料接種到BHI 5mL培養(yǎng)基中，進行選擇性增菌培養(yǎng)，再劃線接種到50mL／L綿羊血瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24h，對可疑菌落進行涂片，革蘭染色后鏡檢。將這些初步確定屬性的菌落進一步用生化實驗進行鑒定。

1.2.2 生化鑒定 用分離的疑似菌純培養(yǎng)物進行各種微量生化鑒定管的接種培養(yǎng)，結果的判定及實驗操作過程嚴格按照說明書的說明。

1.2.3 菌落的PCR鑒定

1.2.3.1 PCR引物的設計與合成 沙門菌，根據(jù)參考文獻中報道的組氨酸轉(zhuǎn)運操縱子基因設計引物［4］：上游：5′－ACTGGCGTTATCCCTTTCTCTGGTG－3′；下游：5′－ATGTTGTCCTGCCCCTGGTAAGAGA－3′。推薦退火溫度（Tm）53℃ 預期擴增片斷大小為496bp，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

巴氏桿菌，根據(jù)參考文獻中報道的巴氏桿菌莢膜基因設計引物［5］，上游引物5′－ATCCGCTATTTACCCAGTGG－3′， 下 游 引 物 5′－GCTGTAAACGAACTCGCCAC－3′。推 薦 退 火 溫 度 （Tm）56℃。預期擴增片段大小為457bp，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

鏈球菌，根據(jù)參考文獻中報道的鏈球菌莢膜多糖 基 因 設 計 引 物［6］，上 游 引 物：5′－GAAAAAGTCAGCATTATTGTA－3′，下 游 引 物 5′－TTAATCGTTGTTCTTTTCTTCCCTAATTAA－3′。 推薦退火溫度（Tm）53℃，預期擴增片段387bp引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.3.2 疑似菌落的PCR檢測 挑取平板上的待檢單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中搖床過夜培養(yǎng)。取1mL菌液提取DNA作為模板，為減少漏檢，提高檢測效率，將3對引物放在同一反應體系里，對同一菌落進行多重PCR反應：

PCR mix：12.5μL，3對引物上游、下游引物Pl、P2（10pmol／μL）各1μL，菌液模板1μL，滅菌雙蒸水7.5μL；反應條件為94℃預變性5min；94℃1min，53℃1min，72℃延伸1min，31個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物于1.2g／L瓊脂糖凝膠電泳，于紫外燈下觀察結果。

1.2.3.3 PCR 產(chǎn)物的克隆、測序及序列分析PCR產(chǎn)物電泳回收后與pMDT－18質(zhì)粒連接，按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞。挑取白色菌落接種LB液體培養(yǎng)基，37℃振搖過夜。將菌液進行PCR鑒定，將鑒定陽性菌液送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。應用DNA Star軟件將獲得各種細菌特異性目標序列分別與GenBank中登錄的其他序列進行同源性比較，以初步確定分離菌株屬性。

2 結果

2.1 細菌分離的結果

2.1.1 疑似沙門菌分離菌株 在普通營養(yǎng)瓊脂平板上，可見微小圓形、透明而略帶灰白、濕潤、邊緣整齊、針尖大的露滴樣菌落；在麥康凱瓊脂平板上呈細小、無色半透明、光滑、圓整菌落，與豬沙門菌的培養(yǎng)特性相符［1］。

2.1.2 疑似多殺性巴氏桿菌分離菌株 在TSA加血清培養(yǎng)基上長成灰白、透明、光滑的中等大小菌落，對光照有藍色熒光，瑞特染色兩極著色，兩端鈍圓，與多殺性巴氏桿菌的培養(yǎng)特性相符［2］。

2.1.3 疑似鏈球菌分離菌株 選擇性增菌后，劃線分離在血瓊脂平板上進行，37℃培養(yǎng)24h，血平板上長出灰白色、圓形、透明、表面光滑、邊緣整齊 、針尖大的露滴樣菌落，菌落周圍出現(xiàn)直徑約1mm的溶血環(huán)。革蘭染色見陽性小球菌。與鏈球菌的培養(yǎng)特性相符［3］。

2.2 生化鑒定結果

2.2.1 疑似沙門菌的生化試驗結果 生化試驗結果表明，可疑菌發(fā)酵葡萄糖、木糖醇、賴氨酸、甘露醇、蔗糖、果糖、山梨醇；不發(fā)酵甘露糖；硫化氫、苯丙氨酸、尿素酶反應呈陰性，與豬沙門菌的生化特性一致［7］。

2.2.2 疑似多殺性巴氏桿菌的生化試驗結果 可疑菌發(fā)酵葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、木糖；不發(fā)酵乳糖、麥芽糖；吲哚、硝酸鹽、鳥氨酸脫羧酶試驗均陽性；脲酶、枸櫞酸、甲基紅、VP試驗均為陰性?？梢删县i多殺性巴氏桿菌的生化特征［7］。

2.2.3 疑似鏈球菌的生化試驗結果 可疑菌發(fā)酵乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇 ；不發(fā)酵木糖、菊糖、棉子糖、肌醇或反應弱；VP、MR以及吲哚試驗均陽性?？梢删县i鏈球菌的生化特征［7］。

2.3 PCR檢測結果

取需鑒定的細菌液體培養(yǎng)物，將設計的沙門菌特異性組氨酸轉(zhuǎn)運操縱子基因、巴氏桿菌特異性莢膜基因以及鏈球菌特異性莢膜多糖基因引物放在同一反應體系里，進行多重PCR擴增，擴增出了3個與預期的大小一致的各自細菌相應的PCR產(chǎn)物，分別見圖1、圖2、圖3。

將PCR擴增的片段各自送一份測序，利用DNA Star軟件與GenBank上登錄的參考菌株序列進行比較，沙門菌同源性達99.5%～99.8%，巴氏桿菌同源性達99.6%～99.7%，鏈球菌同源性達99.5%～99.8%。

綜合分析細菌分離、生化反應以及PCR鑒定結果，本研究共獲得沙門菌19株，鏈球菌15株，巴氏桿菌12株。

圖1 重組細胞組氨酸轉(zhuǎn)運操縱子基因PCR產(chǎn)物Fig.1 The PCR products of reconstitution cell histine transport operon of Salmonella.

圖2 待檢巴氏桿菌莢膜基因PCR產(chǎn)物Fig.2 The PCR products of capsule of Pasteurella

圖3 鏈球菌莢膜多糖基因PCR產(chǎn)物Fig.3 The PCR products of capsular polysaccharide of Streptococcus

3 討論

考慮到目前養(yǎng)豬場普遍存在沙門菌、多殺性巴氏桿菌以及鏈球菌等多種病原菌單獨或混合感染的情況，本文選擇這3種細菌為重點分離目標菌對現(xiàn)場剖檢病豬無菌采集病料，分別按3種病原菌的培養(yǎng)方法進行分離培養(yǎng)，結合生化試驗及PCR檢測，以鑒定細菌屬性。初步摸清了3種病原菌在上海地區(qū)部分豬場的流行分布狀況。

為了準確地鑒定分離培養(yǎng)所得的沙門菌、鏈球菌以及巴氏桿菌。本研究首先對可疑菌落進行生化反應鑒定，再對疑似菌落進一步利用PCR檢測特異性基因片段，分別將擴增的3種細菌的基因片段序列與GenBank上登錄的參考菌株序列進行比較。分離菌株中檢出沙門菌組氨酸轉(zhuǎn)運操縱子基因與GenBank上登錄的其他沙門菌菌株組相應片段的同源性可達99.5%～99.8%；分離菌株中檢出巴氏桿菌特異性莢膜基因與GenBank上登錄的巴氏桿菌相應片段的同源性可達99.6%～99.7%；分離菌株中檢出鏈球菌特異性莢膜多糖基因與GenBank上登錄的鏈球菌相應片段的同源性可達99.5%～99.8%。說明本研究采用的引物在PCR體系中可以準確地檢測各自的目的菌，與相關的文獻［1－3］報道一致。本研究結果顯示，生化試驗鑒定結果與PCR檢測結果符合率為100%，說明本試驗采用的PCR鑒定細菌的方法是可行的。

本研究嘗試用3種引物的多重PCR對同一菌落進行檢測，既可以提高檢出率，還簡化了檢測步驟，為最終建立快速、敏感、準確可靠的檢測方法奠定了基礎。

整個試驗共解剖了31頭豬，分離到了46株不同細菌菌株，其中一些豬只病料中分離到不止一種病原菌，說明混合感染情況的存在。本研究結果也為進一步全面研究上海地區(qū)養(yǎng)豬場主要流行病原菌積累了較為詳細的資料。

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