4種豬瘟病毒抗體檢測方法的比較

馬超英

（青海省海西州烏蘭縣銅普獸醫(yī)站，青海烏蘭 817000）

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起豬的一種高度接觸性、致死性的傳染病，臨床上主要以稽留高熱、皮膚和黏膜出現(xiàn)大量出血點(diǎn)為主要特征［1］。豬瘟具有高度傳染性，主要通過呼吸道和消化道傳染，傳播速度快，發(fā)病率和病死率高，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須報告的動物傳染病，我國也將其列為一類動物疫病，是嚴(yán)重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的最重要的疫病之一［2－6］。近年來，我國豬瘟的流行和發(fā)病特點(diǎn)發(fā)生了很大變化，轉(zhuǎn)變?yōu)殡[性感染和亞病毒感染，在臨床表現(xiàn)上也更加復(fù)雜，既有區(qū)域性流行，又有零星散發(fā)，既有高病死率的急性癥狀，又有持續(xù)感染的溫和性癥狀趨于復(fù)雜化，出現(xiàn)了所謂“非典型豬瘟”、“溫和型豬瘟”和“帶毒母豬綜合征”，在病理剖檢上也常常不同于典型豬瘟的病理變化，給獸醫(yī)臨床診斷帶來了很大困難［7］。目前，豬瘟的診斷方法主要包括病毒的分離與鑒定、血清學(xué)方法及分子生物學(xué)檢測方法［8］。盡管血清學(xué)方法很難有效區(qū)分疫苗毒與野毒產(chǎn)生的抗體，但由于其具有使用方便、一次檢測量大和血清容易保存等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用，在豬瘟流行狀態(tài)的監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查等方面有著重要的作用，也是免疫豬群抗體水平監(jiān)測的主要方法，對疫苗免疫效果評價及免疫程序的制定均具有重要意義［9－11］。本研究應(yīng)用正向間接血凝試驗(yàn)（IHA）、間接ELISA、Dot－ELISA、膠體金免疫層析試紙條（GICA）4種方法分別對142份豬血清樣品進(jìn)行檢測，分析比較4種豬瘟病毒抗體檢測方法的陽性檢出率及敏感性，尋找適合基層獸醫(yī)部門應(yīng)用的抗體檢測方法，為我國豬瘟的綜合防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑盒與血清 豬瘟病毒正向間接血凝試驗(yàn)抗體檢測試劑盒購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所；豬瘟病毒抗體Dot－EIISA檢測試劑盒購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所；豬瘟病毒抗體間接ELISA檢測試劑盒購自深圳市綠詩源生物技術(shù)有限公司；豬瘟病毒抗體金標(biāo)檢測卡購自深圳市康百得生物科技有限公司；檢測用血清樣品142份由魯北獸醫(yī)診斷中心實(shí)驗(yàn)室收集并保存。

1.1.2 主要儀器 8道加樣器為Eppendorf公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀（Model 680）為Bio－Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

按照4種試劑盒說明書提供的方法（正向間接血凝試驗(yàn)（IHA）、間接 ELISA、Dot－ELISA、膠體金免疫層析試紙條（GICA））分別檢測142份血清樣品。

2 結(jié)果

如表1所示，142份血清樣品經(jīng)豬瘟病毒抗體間接ELISA檢測出陽性119份，陽性率為83.8%；豬瘟正向間接血凝試驗(yàn)（IHA）檢測出陽性117份，陽性率為82.4%；豬瘟病毒抗體Dot－EIISA檢測出陽性115份，陽性率為81.0%；豬瘟病毒抗體膠體金試紙條（GICA）檢測出陽性109份，陽性率為76.8%。

如表1所示，4種檢測方法檢測結(jié)果相同樣品數(shù)為124份，總符合率達(dá)87.3%（124／142）。對檢測結(jié)果不相同的18份血清樣品進(jìn)行比較分析，如表2所示，其中編號為A、B、C的9份血清樣品符合間接ELISA、IHA、Dot－ELISA、GICA 陽性檢出率（敏感性）由高到低的順序。編號為D、E的共計(jì)6份血清樣品分別經(jīng)IHA和Dot－ELISA檢測為陽性，間接ELISA檢測為陰性；而編號為F、G的共計(jì)2份血清樣品分別經(jīng)IHA和Dot－ELISA檢測為陰性，其余的檢測方法檢測為陽性，造成以上現(xiàn)象的主要原因可能是檢測方法所用的抗原不同，IHA和Dot－ELISA采用全病毒作為抗原，間接ELISA采用基因工程重組蛋白作為抗原。由于全病毒抗原制備過程繁瑣、受病毒純化方面的限制，純化效果較差，試驗(yàn)的穩(wěn)定性和重復(fù)性均較差，往往導(dǎo)致假陽性和假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。編號為H的1份血清樣品經(jīng)ELISA和Dot－ELISA檢測為陽性，IHA和GICA檢測為陰性，可能是由于血清分離的質(zhì)量和試驗(yàn)操作造成了這一現(xiàn)象，但這一現(xiàn)象的出現(xiàn)率僅為0.70%（1／142），也在試驗(yàn)誤差允許的范圍內(nèi)。

表1 4種檢測方法檢出陽性樣品數(shù)比較Table 1 Comparative detection of four detection methods in clinical samples

（續(xù)表1）

表2 檢測結(jié)果不同的血清樣品統(tǒng)計(jì)比較Table 2 Comparison of different results of serum samples detected by 4methods

3 討論

在豬瘟病毒的抗體檢測方法中，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所的正向間接血凝試劑盒被農(nóng)業(yè)部推薦為豬瘟疫苗抗體檢測的主要方法，也是我國豬瘟抗體檢測的經(jīng)典方法，在國內(nèi)得到了廣泛應(yīng)用，為我國豬瘟的綜合防控做出了巨大貢獻(xiàn)，但該方法存在敏感性低，檢測血清樣品需經(jīng)過滅活處理，增加了檢測時間和檢測難度，且血清的質(zhì)量將嚴(yán)重影響檢測結(jié)果，肉眼判讀、誤差大等缺點(diǎn)，不適合用于流行病學(xué)調(diào)查和規(guī)模化豬場的大范圍、大面積檢測，不適合在基層獸醫(yī)部門廣泛使用。

間接ELISA和Dot－ELISA方法因其具有微量、敏感、特異、高通量的優(yōu)點(diǎn)，在豬瘟病毒的抗體水平檢測上具有巨大的發(fā)展空間和廣闊的應(yīng)用前景，可用于規(guī)模化豬場免疫的抗體水平監(jiān)測。間接ELISA和Dot－ELISA二者具有較高的符合率93.0%（132／142），間接 ELISA 敏感性略高于 Dot－ELISA，間接ELISA方法因其操作過程較繁瑣，對操作人員要求專業(yè)性較高，適合于具有基本實(shí)驗(yàn)條件的基層實(shí)驗(yàn)室。Dot－ELISA因其不需要酶標(biāo)儀等儀器設(shè)備，適用于基層獸醫(yī)部門廣泛使用。

膠體金試紙條特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測反應(yīng)時間短、操作簡便、操作人員不需培訓(xùn)、樣品不需預(yù)處理、無需特殊儀器設(shè)備、特別適合于基層獸醫(yī)部門和規(guī)?；B(yǎng)殖場的快速診斷，為基層獸醫(yī)部門和廣大養(yǎng)殖戶提供了簡單、特異、敏感、快速的診斷方法。

本研究用4種方法同時檢測142份血清樣品，間接ELISA的敏感性最高，檢測陽性樣品119份；正向間接血凝次之，檢出陽性樣品117份；膠體金試紙條最低，檢測陽性樣品109份。當(dāng)然，不排除存在假陽性問題，但在流行病學(xué)調(diào)查中，間接ELISA等敏感性高的檢測方法存在明顯的優(yōu)勢。在對18份檢測結(jié)果不同的血清樣品進(jìn)行比較分析時發(fā)現(xiàn)，IHA和Dot－ELISA由于使用全病毒作為診斷抗原，受病毒培養(yǎng)、純化方面的限制，導(dǎo)致IHA和Dot－ELISA的穩(wěn)定性和重復(fù)性均較差，而間接ELISA采用基因工程重組蛋白作為診斷，這種人工抗原是病毒本身特定的蛋白成份，只能與該病毒特定成份所誘生的抗體發(fā)生反應(yīng)，使間接ELISA的特異性和敏感性均較高。

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