以長(zhǎng)白豬為受體母豬生產(chǎn)克隆五指山小型豬的妊娠診斷

王 偉，崔成哲，李秀元，王曉明，尹熙俊，李文學(xué)＊

（1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133002；2.延邊農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林龍井 133400）

目前，克隆豬技術(shù)在我國(guó)已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，克隆豬研究可以為家豬育種、人類疾病模型和人類異種器官移植研究奠定良好的基礎(chǔ)。其中克隆豬的妊娠診斷是克隆豬技術(shù)中的一個(gè)關(guān)鍵技術(shù)，如果能在早期判斷母豬已經(jīng)受孕，可按妊娠母豬進(jìn)行飼養(yǎng)管理，如未受孕要采取措施，促使母豬再次發(fā)情配種，防止形成空懷母豬，造成飼料浪費(fèi)［1］。另外，在克隆胚著床后全程監(jiān)測(cè)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，懷孕子宮的擴(kuò)張情況并不大，比正常配種懷孕的子宮擴(kuò)張要小得多，臨床實(shí)時(shí)超聲掃描中發(fā)現(xiàn)有的胎兒無(wú)胎動(dòng)，有個(gè)別胎兒外型輪廓看不清。表明克隆胚的體內(nèi)發(fā)育較正常受精卵要差，個(gè)別胎兒發(fā)育異常［2］，妊娠后期可能由于胎兒畸形、發(fā)育不良、死亡、退化、吸收等原因而導(dǎo)致B超檢測(cè)為陰性，故有必要應(yīng)用B超聯(lián)合豬早孕檢測(cè)試劑盒對(duì)受體母豬進(jìn)行妊娠檢測(cè)。

目前對(duì)于五指山小型豬，特別是克隆五指山小型豬的妊娠診斷的研究還較少，并且標(biāo)準(zhǔn)不一，指壓法不易實(shí)現(xiàn)，準(zhǔn)確率低。所以，本試驗(yàn)采用B超聯(lián)合豬早孕檢測(cè)試劑盒對(duì)受體母豬進(jìn)行妊娠診斷，以期確定克隆五指山小型豬早期妊娠診斷的適宜時(shí)間，為克隆五指山小型豬受體妊娠診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 吉林省龍井市農(nóng)業(yè)科技研究所豬場(chǎng)自然發(fā)情的長(zhǎng)白母豬為受體母豬共24頭，編號(hào)采用原豬場(chǎng)的耳號(hào)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)器材及主要試劑 50STringa VET便攜式獸用B超診斷儀，荷蘭PIE MEDICAL公司產(chǎn)品；豬早孕檢測(cè)試盒，龍巖蚨瑞生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 移植的胚胎 移植的胚胎為五指山小型豬2細(xì)胞～4細(xì)胞期克隆胚胎，克隆胚胎的構(gòu)建在吉林省轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與胚胎工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 方法

1.2.1 克隆胚胎移植 2011年5月28日－8月31日，胚胎移植采用手術(shù)方法將克隆胚胎移植到受體母豬一側(cè)或雙側(cè)輸卵管，單側(cè)輸卵管移植150枚～200枚克隆胚。

1.2.2 妊娠檢測(cè) 采用B超聯(lián)合豬早孕檢測(cè)試劑盒對(duì)受體母豬進(jìn)行妊娠檢測(cè)。

1.2.2.1 B型超聲妊娠檢測(cè)法 胚胎移植后第22天開(kāi)始進(jìn)行妊娠檢測(cè)，每周進(jìn)行一次檢查直至分娩。探測(cè)部位可選擇在受體母豬的最后一對(duì)乳頭的腹部?jī)蓚?cè)，用手指狀突陣探測(cè)頭頻率為3.5MHz進(jìn)行掃查診斷。探頭與體軸平行朝向母豬的泌尿生殖道進(jìn)行滑動(dòng)掃查或扇形掃查。探到膀胱后，向膀胱上部或側(cè)面掃查。妊娠超過(guò)1.5月后探查的位置逐漸前移，并且掃查方向也由向后變?yōu)橄蚯埃?］。

1.2.2.2 豬早孕檢測(cè)試劑盒進(jìn)行妊娠檢測(cè) 試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，收集移植（移植當(dāng)天為0 d）后26d～32d或66d之后的受體母豬尿液用于檢測(cè)，用酶標(biāo)儀進(jìn)行數(shù)字化顯示以得出檢測(cè)的詳細(xì)結(jié)果，檢測(cè)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)上的檢測(cè)區(qū)間進(jìn)行。

豬早孕妊娠檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果中，參比對(duì)照組C1值大于C2值，說(shuō)明檢測(cè)試驗(yàn)成功，待檢樣品A值大于C1值判為陰性，表明待檢母豬未妊娠；待檢樣品A值小于C1值判為陽(yáng)性，表明待檢母豬已妊娠；待檢樣品A值在C1值和C2值之間判為可疑，應(yīng)稍后再取樣進(jìn)行重測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 受體母豬B超妊娠檢測(cè)結(jié)果

克隆胚胎移植受體B超妊娠檢測(cè)結(jié)果表明，受體母豬在30d的妊娠率為45.83%（11／24），從后期結(jié)果來(lái)看，30d確診陽(yáng)性準(zhǔn)確率為100%（11／11），檢出率為91.67%（11／12）。由檢測(cè)圖片可以看出，在胚胎移植后30d（圖1），可以檢測(cè)到孕體和胎體反射；52d（圖2）可以檢測(cè)到胎兒的數(shù)量、胎兒骨骼及頭部和脊柱；8 7d（圖3）可檢測(cè)到胎動(dòng)。另外，0126號(hào)和0139號(hào)受體母豬在早期妊娠診斷中結(jié)果為陽(yáng)性，但分別在59d和66d進(jìn)行B超檢測(cè)時(shí)結(jié)果顯示為陰性，故有必要應(yīng)用豬早孕檢測(cè)試劑盒對(duì)受體母豬進(jìn)行進(jìn)一步的妊娠檢測(cè)。

圖1 妊娠30d的B超影像圖，箭頭所示為孕體Fig.1 Real－time B－mode ultrasound image of a 30days fetus，the arrowhead shows the conceptus

圖2 妊娠52d的B超影像圖，箭頭所示為胎兒脊柱Fig.2 Real－time B－mode ultrasound images of a 52days fetus，the arrowhead shows the fetal vertebral column

圖3 妊娠87d的B超影像圖，箭頭所示為胎兒心臟，在檢測(cè)時(shí)看到明顯的胎動(dòng)Fig.3 Real－time B－mode ultrasound images of a 87days fetus，the arrowhead shows the fetal heart，the obvious fetal movement is detected

2.2 豬早孕妊娠檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果

豬早孕妊娠檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1結(jié)果顯示除0139號(hào)和0126號(hào)外，09號(hào)未妊娠，其余全部妊娠。其中，45號(hào)、09號(hào)、177號(hào)為胚胎移植后26d～32d范圍內(nèi)的檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果與B超檢測(cè)結(jié)果完全一致；37號(hào)、3464號(hào)、39號(hào)、0139號(hào)、和0110號(hào)為胚胎移植后66d以上的檢測(cè)結(jié)果，0126號(hào)前后兩個(gè)結(jié)果分別為29d和66d測(cè)得。除了0139號(hào)結(jié)果跟B超檢測(cè)結(jié)果不一致以外，其余結(jié)果全部一致（包括表中未列出的數(shù)據(jù)），但是0139號(hào)在胚胎移植后29d和67d檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，74d發(fā)現(xiàn)母豬有發(fā)情跡象，79d進(jìn)行了第2次試劑盒檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)為陰性。

2.3 分娩情況

截止2011年12月22日，11頭受體母豬妊娠，其中受體母豬成功分娩出67頭克隆五指山小型豬，受體母豬產(chǎn)仔率為6只／頭，圖4為克隆仔豬正在哺乳的場(chǎng)景。新生仔豬因各種原因死亡22頭，死亡率為32.84%。

圖4 哺乳的克隆仔豬Fig.4 cloned suckling piglets

表1 豬早孕妊娠檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果Table 1 The test results of early pregnancy diagnosis kit

3 討論

目前，對(duì)母豬進(jìn)行妊娠檢測(cè)的方法有很多，包括指壓法、碘化法、觀察法、試劑盒檢測(cè)法以及儀器檢測(cè)法等，常規(guī)早期妊娠診斷方法對(duì)于第一情期配種后不發(fā)情而又未孕（占配種頭數(shù)20%左右）的母豬，一般需待到配種后40d～80d左右才能比較有把握地確診是否懷孕。另外，有的經(jīng)產(chǎn)母豬由于上一個(gè)妊娠周期的黃體在配種后20多天仍然存在，導(dǎo)致母豬未受孕但不發(fā)情，這又容易造成妊娠診斷中的誤診，甚至造成更大的經(jīng)濟(jì)損失。

超聲波妊娠診斷技術(shù)［6］近年來(lái)廣泛應(yīng)用于豬的研究中，在國(guó)內(nèi)外報(bào)道較多［2－4］，但是關(guān)于克隆豬的妊娠診斷的報(bào)道相對(duì)較少，并且標(biāo)準(zhǔn)不一。本研究使用50STringa VET便攜式獸用B超診斷儀聯(lián)合豬早孕檢測(cè)試劑盒對(duì)受體母豬進(jìn)行妊娠檢測(cè)。妊娠早期檢測(cè)結(jié)果基本一致，后期除了0139號(hào)檢測(cè)結(jié)果不一致，其余結(jié)果全部一致，這說(shuō)明B超聯(lián)合豬早孕檢測(cè)試劑盒用于克隆五指山小型豬的妊娠檢測(cè)是非常有意義的。本試驗(yàn)中B超檢測(cè)結(jié)果表明，受體母豬在30d的妊娠率為45.83%（11／24），從妊娠后期及分娩結(jié)果來(lái)看，30d確診陽(yáng)性準(zhǔn)確率為100%（11／11），檢出率為91.67%（11／12），妊娠率低于王少華等［2］的研究結(jié)果（30d妊娠率為66.67%（2／3），30d陽(yáng)性準(zhǔn)確率為100%），原因可能是由于王少華等研究的樣本數(shù)太小造成的。本研究中，確定克隆五指山小型豬早期用B超進(jìn)行妊娠診斷的最佳時(shí)間為胚胎移植后30d，結(jié)果與Knox R［3］的結(jié)果一致（24d～35d），但與田超等［5］的研究（22d）相比，妊娠診斷時(shí)間要晚8d；可以準(zhǔn)確檢測(cè)懷胎數(shù)的時(shí)間，與王少華等［2］的結(jié)果相比基本一致（52dvs 50d），但與鄧立新等［1］的結(jié)果相比明顯要晚（52d vs 28d～35d）；能夠檢測(cè)到胎動(dòng)的時(shí)間為胚胎移植后87d，與馮現(xiàn)明等［7］的結(jié)果（40d）相比要晚47d，但比王少華等［2］的結(jié)果相差不多（87dvs 90d）。原因可能是由于除王少華之外，其他研究者檢測(cè)的是普通母豬的正常妊娠過(guò)程，而本實(shí)驗(yàn)研究的是克隆五指山小型豬以長(zhǎng)白豬為受體母豬的妊娠過(guò)程，受體母豬的品種、仔豬的品種、胚胎的獲得途徑和方法都有明顯的區(qū)別造成的，另外，0110號(hào)曾在胚胎移植后44d和52d時(shí)B超檢測(cè)結(jié)果呈陰性，但在后期B超檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)為陽(yáng)性（與試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致），可能是由于克隆豬的胚胎發(fā)育過(guò)程與正常豬也存在一定的差異，在克隆胚胎著床后，隨著胚胎的發(fā)育，懷孕子宮比正常配種懷孕的子宮擴(kuò)張小。另外，王少華等［2］發(fā)現(xiàn)在B超檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)有的胎兒無(wú)胎動(dòng)，個(gè)別胎兒外型輪廓看不清，表明克隆胚的體內(nèi)發(fā)育較正常受精卵要差，個(gè)別胎兒發(fā)育異常。故在克隆豬的早期妊娠診斷過(guò)程中，很可能由于克隆胚在受體母豬體內(nèi)發(fā)育不良而影響B(tài)超檢測(cè)結(jié)果，從而推遲早期應(yīng)用B超進(jìn)行豬的妊娠檢測(cè)［8］的最佳時(shí)間。

豬早孕妊娠檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果表明，豬早孕妊娠檢測(cè)試劑盒用于豬的妊娠檢測(cè)結(jié)果具有很高的準(zhǔn)確性，其中0139號(hào)在胚胎移植后67d檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，在74d發(fā)現(xiàn)母豬有發(fā)情跡象，在79d進(jìn)行了第二次試劑盒檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)為陰性。可能是由于妊娠后期胎兒畸形、發(fā)育不良、死亡、退化、吸收等原因而造成的，豬早孕妊娠檢查試劑盒的檢測(cè)結(jié)果具有很高的準(zhǔn)確性，而且應(yīng)用方便，快捷，為豬早期妊娠診斷提供了新的途徑和方法。故有必要應(yīng)用B超聯(lián)合豬早孕檢測(cè)試劑盒對(duì)受體母豬進(jìn)行妊娠檢測(cè)。

從受體母豬分娩情況可以看出，受體母豬的產(chǎn)仔率僅為6（67／11）只／頭，比較受體母豬的平均產(chǎn)仔率明顯偏少；新生仔豬死亡率為32.84%，明顯偏高。其原因可能是早期克隆胚胎重新程序化異常，致使胚胎發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)缺陷、循環(huán)系統(tǒng)缺陷、免疫缺陷或腎腦功能缺損等，導(dǎo)致胚胎早期死亡以及死胎、弱胎增多有關(guān)，如何提高受體母豬的產(chǎn)仔率以及降低新生仔豬的死亡率有待進(jìn)一步研究。另外，受體母豬的某些疾病以及新生仔豬的疾病也會(huì)影響產(chǎn)仔率和仔豬死亡率，因此，加強(qiáng)產(chǎn)后受體母豬和仔豬的護(hù)理也很重要［9］。

母豬妊娠監(jiān)測(cè)是非常有意義的。B超用于克隆豬的妊娠檢測(cè)能夠及時(shí)地診斷出母豬子宮的妊娠變化，包括胎動(dòng)、胎兒數(shù)目、胎心跳和胎兒發(fā)育狀況，從而對(duì)胎兒進(jìn)行全過(guò)程的監(jiān)測(cè)和跟蹤［10］。同時(shí)，聯(lián)合豬早孕妊娠檢測(cè)試劑盒又能夠及時(shí)排除干擾，提高克隆豬妊娠診斷的準(zhǔn)確率。

［1］鄧立新，王國(guó)謹(jǐn)，程福成.B超在母豬妊娠和排卵監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用［J］.豬業(yè)科學(xué)，2008，25（7）：48.

［2］王少華，楊文科，葉 鋒，等.獸用B超在克隆豬研究中妊娠診斷的應(yīng)用［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2007.34（1）：152－154.

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［5］田 超.獸用B超在豬繁育中的應(yīng)用研究［D］.河南鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，2009.

［6］謝富強(qiáng).獸醫(yī)影像學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2010：287－297.

［7］馮現(xiàn)明.B超在母豬懷孕鑒定中的應(yīng)用［J］.河南畜牧獸醫(yī)，2005，26（11）：24.

［8］吳建光，熊道煥.小動(dòng)物腹部超聲顯像探查技術(shù)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，1999，20（4）：18－21.

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［10］劉賢俠，徐 奇，武 磊，等.應(yīng)用B超對(duì)母豬進(jìn)行早期妊娠診斷的研究［J］.畜禽業(yè)，2009（7）：36－39.