骨傷寧軟膏中紅花藥材的提取工藝研究

楊文娟，牛 陽，王 榮，毛跟年

（1.陜西科技大學，陜西西安 710021；2.寧夏醫(yī)科大學，寧夏銀川 750004）

骨傷寧軟膏是寧夏吳忠回醫(yī)正骨醫(yī)院臨床用于治療骨折中后期的有效制劑，能夠改善骨折部位的生物力學性能，對骨痂內(nèi)骨膠原的積累和鈣鹽沉積有促進作用，改善蛋白代謝，促進蛋白質(zhì)多糖合成及鈣化，加速骨痂的形成和骨折愈合的時間。不僅保證了骨折愈合，促進骨痂生長，還能防止骨不連發(fā)生［1］。骨傷寧軟膏中含有紅花、海螵蛸、自然銅等藥材，其中紅花藥材用藥量大，具有活血散淤、消腫止痛的作用，本文采用正交實驗法，以紫外分光光度法測定紅花提取液中羥基紅花黃色素A（HSYA）的含量，同時考慮到骨傷寧軟膏在制劑成型中對原料產(chǎn)量的要求，故將提取工藝的干膏率也作為該工藝的評價指標之一，對這兩項指標綜合評價，以優(yōu)選提取骨傷寧軟膏中紅花藥材的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材 紅花產(chǎn)地新疆，購于西安鹿鳴中藥飲片廠，為菊科植物紅花（CarthamustinctoriusL.）的干燥花。方中海螵蛸、自然銅等藥材經(jīng)鑒定均為正品藥材。HSYA 對照品（批號111637－200803），由中國藥品生物制品檢定所供應。

1.1.2 儀器 754PC型紫外－可見分光光度計為上海菁華科技儀器有限公司產(chǎn)品，F(xiàn)A1004N電子分析天平為上海精科天平儀器廠產(chǎn)品，DHG－9123A臺式鼓風干燥器為上海精宏試驗設備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 HSYA含量測定

1.2.1.1 檢測波長的確定 分別配制HSYA對照品以及骨傷寧軟膏各藥材水提取液，在200nm～500nm范圍內(nèi)進行掃描，以HSYA及水提取液的最大吸收波長作為檢測波長。

1.2.1.2 HSYA標準曲線確定 精密稱取HSYA對照品0.001 2g，蒸餾水溶解后轉移至10mL量瓶中，制成儲備液。分別量取儲備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL對照品溶液于10mL量瓶中，蒸餾水定容至刻度，搖勻，配制成濃度分別為2.4、4.8、7.2、9.6、12.0、14.4μg／mL的標準品溶液，在最大吸收波長處測定吸光度，繪制標準曲線，計算回歸方程。

1.2.1.3 方法學考察 為了保證HSYA含量測定方法的可靠性，對該含量測定方法進行精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、加樣回收率等方法學考察。精密度試驗取同一份HSYA對照品溶液連續(xù)測定5次，計算相對標準偏差（RSD）；重現(xiàn)性試驗取同一份水提液連續(xù)測定5次，計算RSD；穩(wěn)定性試驗取同一份HSYA對照品溶液在15、30、45、60、75、90min測定，計算RSD；加樣回收率試驗取已知濃度的同一水提取液6份，分別加入相當于已知濃度60%、80%、100%的HSYA對照品溶液各2份，計算回收率。

1.2.2 水提浸膏的制備 稱量按處方比例混合的海螵蛸、自然銅等藥材1.8g，用10倍量水在常溫下浸泡30min，然后按處方量加入紅花藥材，按照表1安排的正交實驗條件，加入一定倍量水，在一定溫度下溫浸一定時間，抽濾，濾液留用。藥渣按同樣條件處理，抽濾，合并2次濾液。取少量濾液按照1.2.1項下方法測定HSYA含量。將合并后濾液轉移至干燥恒重蒸發(fā)皿中，于水浴蒸發(fā)至干，105℃干燥3 h，移至干燥器中，冷卻30min，迅速精密稱重，計算干膏率。以HSYA含量和干膏率為綜合評價指標，權重系數(shù)均為0.5。

1.2.3 提取工藝的正交實驗設計 根據(jù)預試驗和文獻報道［2－5］，選取加水倍量、提取溫度、提取時間等3個影響因素，每個因素選3個水平，按表1設計L9正交試驗。

表1 因素水平Table 1 Factors and levels

1.2.4 提取工藝的驗證試驗 根據(jù)正交試驗結果得到骨傷寧軟膏的水提取工藝，為了保證該工藝的重現(xiàn)性，對該工藝進行3次驗證試驗。

2 結果

2.1 檢測波長的確定

以蒸餾水為參比液，對HSYA對照品溶液以及水提取液在200nm～500nm范圍內(nèi)進行掃描，得到最大吸收波長均在404nm處，因此，采用404nm為骨傷寧軟膏紅花藥材提取工藝中HSYA含量測定的檢測波長。

2.2 HSYA標準曲線

以濃度（C）對吸光度（OD）做標準曲線，并進行線性回歸分析，結果表明，HSYA對照品溶液在濃度與吸光度之間呈現(xiàn)良好的線性關系，經(jīng)回歸處理得方程：C＝45.56OD－0.004 2，R2＝0.999 7（圖1）。

2.3 方法學考察結果

精密度試驗結果顯示，連續(xù)測定同一HSYA對照品溶液5次，RSD為0.61%，方法精密度良好；重現(xiàn)性試驗結果顯示，連續(xù)測定同一份水提液5次，RSD為0.83%；穩(wěn)定性試驗結果顯示，每隔15min測定HSYA對照品溶液吸光度，RSD為0.86%，表明HSYA對照品溶液在90min內(nèi)穩(wěn)定性良好；加樣回收率試驗結果顯示，6次試驗的平均回收率為99.5%。

圖1 HSYA標準曲線和回歸方程Fig.1 Standard curve and regression equation of HSYA

2.4 提取工藝正交試驗結果

按照1.2.2中水提浸膏的方法及表1的因素水平進行正交試驗，結果見表2。由表2中極差R值可知，影響因素主次為A＞B＞C，表3的方差分析結果表明，影響因素主次為A＞B＞C，即提取溫度是影響HSYA提取率的主要因素，這與HSYA對熱不穩(wěn)定，遇熱易分解的性質(zhì)相符［6－8］，最佳提取工藝為A1B3C3。由正交試驗的9次試驗結果可知，方案3（A1B3C3）的綜合指標分數(shù)最高，這與直觀分析和方差分析后的結果一致。

表2 正交試驗結果Table 2Results of orthogonal test

2.5 提取工藝驗證試驗結果

對正交試驗結果優(yōu)選的最佳提取工藝A1B3C3進行3次驗證試驗，結果見表4。結果表明，試驗重現(xiàn)性好，工藝穩(wěn)定，HSYA含量較高，且干膏率也符合骨傷寧軟膏制備所需的原料要求，故最佳提取工藝為A1B3C3，即加水15倍量，在70℃下溫浸90 min，提取2次。

表3 方差分析結果Table 3Results of variance analysis

表4 驗證試驗結果Table 4Results of verifying test

3 討論

骨傷寧軟膏為回藥治療骨傷的傳統(tǒng)方，具有續(xù)破折，止血收斂，止痛，生肌的功效，臨床主治筋肉斷裂、創(chuàng)傷不愈、血流不止等病癥。骨折愈合的過程就是“淤去、新生、骨合”的過程，對“折傷”的論治，歷代醫(yī)家強調(diào)了活血、益氣，補腎幾方面，強調(diào)活血化淤在骨折損傷治療中的重要性［9］。方中包括紅花、自然銅、海螵蛸等具有活血化淤、祛風利濕、止痛功效藥材。海螵蛸、自然銅等為礦石、骨甲類藥材，按照中藥煎煮原則，屬于先煎藥材，有效成分用水冷浸后再進行熱水提取。紅花為植物的花，質(zhì)地較輕，按照中藥煎煮原則，屬于后下藥材，先冷浸一定時間再進行提取。其中紅花藥材用量最大，HSYA為活血化瘀的主要活性成分［10－11］，在水中的穩(wěn)定性要優(yōu)于在乙醇中［12］，且對熱不穩(wěn)定，故選擇熱水溫浸法進行提取?？紤]到對溫度敏感，因此在試驗中設置了對提取溫度的考察，結果表明，提取溫度是影響HSYA提取的關鍵因素。此外，考慮到藥材提取物得率是影響制劑制備原料的重要因素，因此，將干膏率與HSYA含量綜合評分。由正交試驗數(shù)據(jù)分析可知，最佳組合A1B3C3與正交試驗方案3的組合一致。通過對該最佳工藝進行驗證試驗的結果可以看出，工藝A1B3C3的干膏率和HSYA含量穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，工藝可操作性好。故選擇A1B3C3為骨傷寧軟膏紅花藥材提取工藝的最優(yōu)組合方案。

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