黃芪雜多糖通過調(diào)節(jié)IL－6和PG－1的表達提高仔豬免疫力

范闊海，張 蓓，李娟娟，李宏全

（山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山西太谷 030801）

天然來源的多糖是一類大分子，它對免疫系統(tǒng)有重要影響，因此在臨床應用上可能作為一種免疫調(diào)節(jié)劑［1－2］。黃芪多糖 （Astrgaluspolysaccharides，APS）是從中藥黃芪中提取出的多糖類物質(zhì)［3］。據(jù)相關研究報道，APS具有增強或調(diào)節(jié)免疫的功能，Li研究證明APS通過調(diào)節(jié)體液免疫和細胞免疫對Ⅰ型糖尿病的小鼠有免疫治療作用［4］；Kong X 等［5］通過體內(nèi)和體外試驗證明，APS通過促進外周淋巴細胞增殖和增加血清中抗體來發(fā)揮增強免疫的作用。豬源抗菌肽PG－1屬于Cathelicidin家族，具有廣譜抗菌活性，在動物機體免疫中發(fā)揮著重要的作用［6－7］。Cathelicidin 基因的 5′端啟動子區(qū)域包含NF－κB、NF－IL－6和IL－6等調(diào)控因子結合的位點，這表明Cathelicidin基因的表達可能被這些因子所調(diào)控［8－9］。Wu H 等［10］將脂多糖（LPS）、白介素－6（IL－6）、全反式視黃酸（ATRA）與豬骨髓細胞一起進行體外培養(yǎng)，通過Northern blot檢測發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)上清液中的PG－1和PR－39mRNA表達水平顯著增加。但黃芪多糖對仔豬的免疫調(diào)控作用如何以及發(fā)揮作用的機制尚不清楚。本試驗通過給仔豬體內(nèi)注射AHPS注射劑，設定不同的劑量組，研究主要產(chǎn)生IL－6的T淋巴細胞和單核細胞的活性，檢測IL－6的表達量和PG－1基因的表達水平，分析T淋巴細胞和單核細胞的活性、IL－6的表達量、PG－1基因的表達水平與AHPS劑量的相關性，來研究黃芪多糖對仔豬的免疫調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 按照本課題組報道的微波萃取法制備 AHPS［11－13］，參 考 《中 國 藥 典 》自 制 AHPS 注 射劑，通過中藥制劑的9項安全檢查確定自制注射劑可用于動物試驗。淋巴細胞分離液，天津灝洋生物有限公司產(chǎn)品；Trizol試劑，Invitrogen公司產(chǎn)品；豬IL－6ELISA 試 劑 盒，美 國 R○RD 公 司 產(chǎn) 品；DNA Marker DL2000和 SYBR PrimeSciptTM RT－PCR Kit（Perfect Real Time），寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 組織材料 12頭健康杜長大雜交仔豬，體重為10kg±1kg，20日齡仔豬購自山西天祿豐種豬育種有限公司養(yǎng)豬場，未注射過疫苗，健康，觀察飼養(yǎng)15 d后，將其隨機分為4組（每組3頭），其中1組為對照組，3組分別為注射50、100、200mg／kg體重劑量的AHPS試驗組，每日注射1次，連續(xù)注射7d。注射黃芪多糖的第1、3、5、7天采血，分抗凝血和非抗凝血兩種，分別用于T淋巴細胞和單核細胞的增殖活性和IL－6含量的檢測；第7天采血后處死仔豬，無菌條件下取股骨骨髓，置于DEPC處理過的EP管中，立即放入液氮中保存，用于總RNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 T淋巴細胞和單核細胞的增殖活性檢測在2mL抗凝血中加等體積的無血清RPMI Medium 1640培養(yǎng)基，將其緩慢加入至淋巴細胞分離液中，離心分層，吸取灰白色的中間層，主要為外周血單個核細胞。用含100mL／L胎牛血清的RPMI－1640重懸洗滌后的外周血單個核細胞，接種至一次性培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，在37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h后，非貼壁細胞為淋巴細胞（97%以上為T淋巴細胞），貼壁細胞即為單核細胞。將非貼壁細胞懸液吸出離心，1 000 r／min，10min，棄上清，加含100mL／L胎牛血清的RPMI－1640重懸；將貼壁的單核細胞用2.5g／L胰蛋白酶進行消化，37℃培養(yǎng)箱中消化15min，胎牛血清終止消化，加完全RPMI－1640培養(yǎng)基重懸，臺盼藍染色計數(shù)測活性均在95%以上，將細胞濃度均調(diào)整為1×106個／mL。用MTT法檢測T淋巴細胞和單核細胞的增殖活性。

1.2.1.1 MTT法測定T淋巴細胞活性 于96孔培養(yǎng)板中加入T淋巴細胞懸液100μL，使每孔細胞為1×105個，每頭豬做了5個重復，同時設無細胞孔作為調(diào)零孔及試驗孔。用完全RPMI1640培養(yǎng)基將每孔補至200μL，試驗孔加入CoA（終濃度為5 μg／mL），在37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，培養(yǎng)結束前4h，從每孔吸出100μL上清，再加 MTT（5μg／mL）15μL，繼續(xù)培養(yǎng)，結束前將上清完全棄去，然后加150μL DMSO溶解細胞，10min內(nèi)用酶標儀測定各孔OD 590nm值，來判定淋巴細胞的增值情況。

1.2.1.2 MTT法測單核細胞活性 于96孔培養(yǎng)板中加入100μL單核細胞懸液，使每孔細胞為1×105個，每頭做5個重復，同時設無細胞孔為調(diào)零孔。用完全RPMI1640培養(yǎng)基將沒孔補至200μL，在37℃、體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h使單核細胞貼壁，從每孔吸出100μL上清，每孔加入15μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，將上清完全棄去，加150μL DMSO溶解細胞，10min內(nèi)用酶標儀測定各孔OD 590nm值，來判定單核細胞的增殖情況。

所有測定數(shù)據(jù)結果用SPSS16.0統(tǒng)計學軟件處理，對結果進行因果方差分析Duncan′s多重比較。結果用平均數(shù)±標準差（±SD）表示。

1.2.2 IL－6含量檢測 將采取的非抗凝血，3 000 r／min離心20min，吸出上清，按照ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測上清中IL－6的含量。ELISA試驗數(shù)據(jù)用CurveExpert 1.3分析得出，所有試驗數(shù)據(jù)應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差（One－Way ANVOA）分析，進行t檢驗，所有試驗數(shù)據(jù)都以平均數(shù)±標準差（±SD）表示。

1.2.3 骨髓PG－1mRNA表達水平的測定

1.2.3.1 骨髓總RNA的提取與引物設計 根據(jù)Trizol試劑盒說明書提供的步驟，提取骨髓總RNA，電泳檢測完整性，使用ND－1000微量核酸蛋白測定儀測定其濃度。根據(jù)NCBI公布的豬PG－1和β－actin基因序列，借助Primer5.0plus軟件設計特異性引物（表1），由北京華大基因研究中心合成。

表1 目的基因和內(nèi)參基因的引物序列Table 1 Sequences of primers of target and house－keeping gene

1.2.3.2 實時熒光定量PCR 將提取的各樣本RNA濃度歸為同一濃度，按照寶生物工程（大連）有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒方法，以Oligo（dT）為反轉(zhuǎn)錄引物，合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件為37℃15min，85℃5s。

取反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，以特異性引物進行PCR擴增。反應體系物為25μL：cDNA 2μL，dNTPs 2μL，10×buffer 2.5μL，特異上下游引物0.5μL，TaqE 0.25μL，無菌水17.75μL。反應條件：95℃10s；95℃5s，58℃20s，72℃20s，40個循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物用20g／L的瓊脂糖凝膠電泳檢測。將目的條帶切割回收后送交寶生物工程（大連）有限公司雙引物測序。

取反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA，按照2倍梯度稀釋5個濃度標準做標準曲線。每個樣品分別使用PG－1基因和β－actin基因進行實時熒光定量RT－PCR擴增，反應分別在密閉的定量PCR管中進行。反應體系：SYBR?Premix ExTaqTM （2×）12.5μL、PCR Forward Primer 0.5μL、PCR Reverse Primer 0.5 μL、cDNA溶液1μL、ROX Reference DyeⅡ（50×）0.5μL、加dH2O至25μL。反應條件：95℃預變性10s；95℃10s，58℃ 15s，72℃ 20s，45個循環(huán)；95℃1min，55℃30s，95℃30s。每個樣本、PG－1基因、β－actin基因重復3次。反應結束，由熔解曲線判定PCR反應的特異性，根據(jù)標準曲線以及熒光曲線的CT值計算定量結果（結果用平均值±標準差表示）。通過2－△△CT法計算PG－1在不同劑量組和對照組中的基因相對表達水平，△CT目的基因＝CT目的基因－CT內(nèi)參基因，△△CT＝△CT劑量組－△CT對照組，PG－1mRNA表達差別倍數(shù)以2－△△CT表示。

2 結果

2.1 黃芪多糖對T淋巴細胞和單核細胞增殖活性的影響

在注射AHPS同一時間段內(nèi)，不同劑量下，MTT法檢測T淋巴細胞增殖的統(tǒng)計分析結果顯示，注射后第3天與對照組相比，高劑量組和中劑量組的T淋巴細胞增殖活性差異極顯著（P＜0.01），而低劑量組差異不顯著（P＞0.05）；注射后第5天與對照組相比，高、中劑量組均差異極顯著（P＜0.01），低劑量組差異顯著（P＜0.05）；注射后第7天與對照組相比，高、中劑量組均差異極顯著（P＜0.01），低劑量組差異顯著（P＜0.05）（圖1A）。檢測單核細胞增殖結果的統(tǒng)計分析顯示，在注射APS后的第3、5、7天的時候，高、中、低劑量組的單核細胞增殖活性與對照組相比，均差異極顯著（P＜0.01）（圖1B）。

圖1 黃芪雜多糖對仔豬外周血中的T淋巴細胞和單核細胞增值活性的影響Fig.1 Effect of AHPS on proliferation of T lymphocytes and monocytes in the peripheral blood of piglets

2.2 IL－6含量的檢測

ELISA檢測血清中IL－6含量的統(tǒng)計分析顯示，在注射AHPS后的第3、5、7天，AHPS處理的各組的IL－6含量均顯著高于空白對照組（P＜0.01），IL－6含量隨著注射天數(shù)的增加逐漸增加。除第1天外，在注射的相同時間內(nèi)，IL－6含量變化呈劑量依賴性增加（圖2）。

2.3 骨髓中PG－1mRNA的表達水平

通過2－△△CT法計算PG－1在注射不同劑量的AHPS后的基因相對表達水平。結果顯示，PG－1基因在低、中、高劑量組的表達水平分別是對照組的1.6174、2.0556和2.7132倍，且呈劑量依賴性增加（圖3）。

3 討論

黃芪藥理作用廣泛，能調(diào)節(jié)機體免疫功能，增強細胞代謝，調(diào)節(jié)DNA復制及RNA和蛋白質(zhì)的合成［14］，黃芪多糖提取于黃芪，大量研究證明APS作為免疫調(diào)節(jié)劑在免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要的作用。Chen H L等［15］通過體外和體內(nèi)試驗均已證明APS通過促進外周淋巴細胞增殖、增肌血清抗體、增加一氧化氮（NO）和白介素－2（interleukin－2）的產(chǎn)生來發(fā)揮潛在的免疫刺激活性。APS還可激活小鼠的B細胞和巨噬細胞［16－17］。T淋巴細胞和單核細胞在機體免疫中發(fā)揮著重要的作用，其中T淋巴細胞主要來源于骨髓的多能干細胞，參與機體的細胞免疫。而單核細胞代表機體總的細胞免疫水平［18］，抗體的產(chǎn)生、細胞因子的釋放、細胞殺傷作用的變化等都是以此為基礎的。激活的單核細胞能產(chǎn)生并釋放大量的多種的細胞毒素、干擾素和白介素，參與機體的防衛(wèi)機制，而活化的T淋巴細胞和外周血單核細胞是主要產(chǎn)生IL－6的免疫細胞。IL－6可促進多種細胞的增值和分化，它的這種多能性是由廣泛表達于多種細胞表面的IL－6受體介導的，可以通過其受體活化胞內(nèi)的一系列信號蛋白分子從而實現(xiàn)反應基因的誘導表達［19］。研究表明IL－6主要有Jak／STAT和 Ras／NF－IL－6這兩條信號轉(zhuǎn)導通路，轉(zhuǎn)錄因子STAT3（signal transducer and activator of transcription，STATs）和 NF－IL－6分別參與這兩條通路。當作用細胞受到IL－6的刺激后，其受體活化激活這兩條通路中的JAK激酶和MAPK激酶，進而使轉(zhuǎn)錄因子Stat3和NF－IL－6磷酸化，活化了的Stat3和NF－IL－6可與反應蛋白基因中啟動子區(qū)域的IL－6反應成分結合，從而實現(xiàn)對反應基因的誘導表達［20］。

圖2 血清中IL－6含量Fig.2 IL－6contents in serum

圖3 不同黃芪多糖注射劑量對骨髓PG－1mRNA表達量的影響Fig.3 Effects of APS on the expression level of PG－1mRNA in marrow

目前已經(jīng)確認在抗菌肽Protegrins中，其前3個外顯子編碼的前導肽序列的5′端的調(diào)控區(qū)域中存在幾個潛在的調(diào)控模塊，在這個區(qū)域中存在著與動物免疫密切相關的NF（nuclesr factors）因子結合位點，如 NF－κB、NF－IL－6、IL－6反應因子、APRE（急性炎性反應因子）、γ干擾素反應因子和細菌LPS（脂多糖）［21］。根據(jù)大量研究結果可以推測一些免疫調(diào)節(jié)劑是通過IL－6調(diào)控PG－1的表達。以此為出發(fā)點，本試驗通過對比不同劑量AHPS注射組與空白對照組的仔豬血液內(nèi)的T淋巴細胞和單核細胞的增殖活性、IL－6含量，骨髓中PG－1基因的表達水平，并將它們之間的相關性進行分析表明，AHPS肌肉注射于豬體內(nèi)后，機體內(nèi)生成IL－6的T淋巴細胞和單核細胞的活性增強，IL－6的含量增加，使抗菌肽PG－1的表達量升高，證實了體內(nèi)注射黃芪多糖所產(chǎn)生這樣的結果的機理是和體外試驗的結果一致，AHPS 誘 導IL－6 的 產(chǎn) 生，IL－6刺 激 Stat3 和NF－IL－6活化，從而上調(diào)PG－1表達。具體的作用機制需進一步的研究。

［1］Tzianabos A O.Polysaccharide immunomodulators as therapeutic agents：Structural aspects and biologic function［J］.Clini Microbiol Rev，2000，13：523－533.

［2］謝燕霞，安利國，楊桂文.植物多糖對巨噬細胞的免疫調(diào)節(jié)作用［J］.中國生物化學與分子生物學報，2008，24（4）：307－314.

［3］Cui R，He J C，Wang B，et al.Suppressive effect ofAstragalusmembranaceusBunge on chemical hepatocarcinogenesis in rats［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2003，51：75－80.

［4］Li R J，Qiu S D，Chen H X，et al.The immunotherapeutic effects ofAstragaluspolysaccharide in type 1diabetic mice［J］.Biol Pharm Bull，2007，30（3）：470－476.

［5］Kong X，Hu Y，Rui R，et al.Effects of Chinese herbal medic－inal ingredients on peripheral lymphocyte proliferation and serum antibody titer after vaccination in chicken［J］.Inter Immunopharmacol，2004，4：975－982.

［6］Miyasaki K T，Iofel R，Lehrer R I.Sensitivity of periodontal pathogens to the bactericidal activity of synthetic protegrins［J］.J Dental Res，1997，76（8）：1453－1459.

［7］Cheung Q C，Turner P V，Song C，et al.Enhanced resistance to bacterial infection in protegrin－1transgenic mice［J］.Antimicrob Agents Chemother，2008，52（5）：1812－1819.

［8］Gudmundsson G H，Agerberth B，Odeberg J，et al.The human gene FALL39and processing of the cathelin precursor to the antibacterial peptide LL－37in granulocytes［J］.Eur J Biochem，1996，238：325－332.

［9］Zhao C Q，Ganz T，Lehrer R.Structures of genes for two cathelin－associated antimicrobial peptides：prophenin－2and PR－39［J］.FEBS Lett，1995，376：130－134.

［10］Wu H，Zhang G，Minton J E，et al.Regulation of cathelieidin gene expressin：induction by lipopolysaccharide，interleukin－6，retinoicacid，and salmonella enterica serovar typhimurium infection［J］.Infec Immun，2000，68：5552－5558.

［11］Li H Q，Zhao M C.Optimizing microwave－assisted extraction technology ofAstragaluspolysaccharides with response surface methodology［J］.J Tradit Chin Vet Med，2007，26：10－14.

［12］Li H Q，Zhao W G，LüX H.Analysis of chemical components and structure and bioactivity on immunopotentiatorAstragaluspolysaccharides［J］.J Tradit Chin Vet Med，2008，27：5－8.

［13］楊麗華，邱建東，李宏全.黃芪雜多糖調(diào)節(jié)AA小鼠紅細胞免疫黏附功能的研究［J］.藥學學報，2009，44（12）：1364－1370.

［14］Su L，Mao J C，Gu J H，et al.Effect of intravenous drip infusion of cyclophosphamide with high－doseAstragalusinjection in treating lupus nephritis［J］.Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao，2007，5（3）：272－275.

［15］Chen H L，Li D F，Chang B Y，et al.Effects of Chinese herbal polysaccharides on the immunity and growth performance of young broilers［J］.Poult Sci，2003，82：364－370.

［16］Shao B M，Xu W，Dai H，et al.A study on the immune receptors for polysaccharides from the roots ofAstragalus membranaceus，a Chinese medicinal herb［J］.Biochem Biophysi Res Communica，2004，320：1103－1111.

［17］Lee K Y，Jeon Y J.Macrophage activation by polysaccharide isolated fromAstragalusmembranaceus［J］.Internat Immunopharmacol，2005，5：1225－1233.

［18］Frederic G，Markus G，Manz M H，et al.Development of monocytes，macrophages，and dendritic cells［J］.Science，2010，327（5966）：656－661

［19］宋 倫，沈倍奮.IL－6信號轉(zhuǎn)導機制［J］.國外醫(yī)學：免疫學分冊，1999，22（2）：79－83.

［20］Dimitrios T，Theodoros V.Molecular mechanisms of action of interleukin－6（IL－6）［J］.Pneumon，2007，20：154－166.

［21］Hua W，Christopher R，F(xiàn)rank B.Characterization of an upstream open reading frame in the 5－untranslated region of PR－39，a cathelicidin antimicrobial peptide［J］.Mol Immunol，2002（39）：9－18.