西藏當雄縣無漿體分子流行病學調查

孫彩琴，劉建枝，黃 磊，羅布頓珠，汪月鳳，劉志杰，羅建勛，殷 宏＊

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室 甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室，甘肅蘭州 730046；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏拉薩 850009；3.西藏大學農(nóng)牧學院，西藏林芝 860000）

無漿體?。ˋnaplasmosis）（舊稱邊蟲?。┦墙?jīng)蜱傳播的細胞內專性寄生的一類立克次體目無漿體科無漿體屬的無漿體引起的疾病［1］。該病多發(fā)于牛、羊、鹿等反芻動物，菌體寄生于宿主紅細胞內。病程常呈慢性經(jīng)過，臨床癥狀為高熱、貧血、黃疸和漸進性消瘦，急性發(fā)病時可導致動物死亡［2］。目前研究最多的動物無漿體有3種，即邊緣無漿體（A.marginale）、中央無漿體 （A.centrale）和羊無漿體（A.ovis）。硬蜱是羊無漿體的主要傳播媒介。我國西北廣大養(yǎng)羊區(qū)羊無漿體的媒介蜱有3種，它們分別為分布在甘肅和寧夏的草原革蜱（Dermacentor nuttalli）、內蒙古西部地區(qū)的亞東璃眼蜱（Hyalommaasiaticum）和短小扇頭蜱 （Rhipicephaluspurmilio），并證明這3種蜱對羊無漿體的傳播方式都是間歇性吸血傳播。

無漿體的常規(guī)診斷主要是根據(jù)流行史、臨床癥狀、尸體剖檢和血涂片檢查等進行綜合診斷。但常規(guī)檢測難以發(fā)現(xiàn)早期感染，亦不利于大規(guī)模的流行病學調查，分子生物學診斷方法可彌補常規(guī)檢測方法的不足。分子生物學診斷方法主要有核酸探針檢測法、反向線狀印跡雜交技術（RLB）［3］和聚合酶鏈式反應（PCR）。PCR技術已被用在大多數(shù)無漿體病原的檢測上，由于邊緣無漿體、中央無漿體和羊無漿體的MSP5基因和MSP2基因之間的同源性較高，已成為屬特異性PCR檢測的主要目標基因。另外，主要抗原蛋白1（MAP1）和16SrRNA基因也是常用的靶基因。16SrRNA基因是目前常用于細菌分類鑒定的基因之一，尤其適用于不能培養(yǎng)的病原菌的分類鑒定，該基因在無漿體病原分類鑒別上已經(jīng)有了廣泛的應用。

無漿體病多發(fā)于夏秋季，與媒介蜱的活動季節(jié)相一致，在3月～6月出現(xiàn)，8月～10月達高峰，11月尚有個別病例。銀盾革蜱（DermacentorniveusNeumann，1987）與西藏革蜱（D.everesitianusHirst，1926）是我國西部省區(qū)常見的蜱種。它們都是高原蜱種，2月到6月是其活動高峰期，D.niveus分布于陜西、青海、甘肅、新疆和西藏，D.everesitianus分布于高原灌叢草原，多在海拔4 000m以上。當雄（藏語意為“挑選的草場”），位于西藏自治區(qū)中部，可利用草場面積70萬hm2，該縣是個牧業(yè)生產(chǎn)縣，其中綿羊22.46萬只，占家畜存欄總數(shù)的42.55%。無漿體病的分布對當?shù)氐酿B(yǎng)羊業(yè)構成了潛在的威脅。本研究采用無漿體屬特異性引物從蜱的全基因組中擴增16SrRNA基因的部分片段，對西藏當雄地區(qū)蜱無漿體感染率及種類進行分子流行病學調查和遺傳進化分析，為該地無漿體病的診斷和防控提供流行病學資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 2011年5月份從西藏當雄縣三個地區(qū)即當雄縣城地區(qū)、烏瑪鄉(xiāng)和龍仁鄉(xiāng)的綿羊身上采集未叮咬的成蜱樣品。樣品保存在750mL／L的乙醇中，帶回實驗室后由專業(yè)人員根據(jù)形態(tài)學對蜱進行種類和性別鑒定。

1.1.2 主要儀器和試劑 基因組提取試劑盒：QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN，Hilden，Germany）；PCR 儀：My cycler thermal cycler （BIORAD），DNA Engine peltier Thermal Cycler（BIORAD）；DYY－Ⅱ型電泳儀，北京六一儀器廠生產(chǎn)；JS－680B全自動凝膠成像分析儀，上海培清科技有限公司生產(chǎn)；DNA凝膠回收試劑盒，LATaqDNA聚合酶和 dNTP，10×PCR buffer，克隆載體pGEM－T Easy，大腸埃希菌JM109，均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 引物 EE1／EE2［3］可擴增無漿體16SrRNA基因，具有無漿體屬特異性，預擴增的目的片段長度為1 430bp，由寶生物工程（大連）有限公司合成，序列如下：EE1：5′－TCCTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGC－3′；EE2：5′－AGTCACTGACCCAACCTTAAATGGCTG－3′。

1.2.2 樣品DNA提取及PCR擴增 樣品DNA的提取方法參照QIAamp DNA Mini Kit說明書進行。首先用雙蒸水潤洗10min，置于吸水紙上，晾干后放入1.5mL的Eppendorf管中（每管1只）；每管中加入50μL PBS（pH7.2）緩沖溶液，利用消毒好的剪刀和鑷子將其盡量剪碎；各管中加入180μL ATL溶液，20μL蛋白酶K，渦旋混勻，置于56℃加熱器中3h使得組織充分裂解；短暫離心后，加入200μL AL溶液，脈沖式渦旋15s，70℃孵育10min；短暫離心后，加入200μL無水乙醇，同上進行渦旋；將QIAamp層析柱安裝到2mL收集管中，把上一步驟中得到的混合物轉入層析柱中，靜置1min后，8 000 r／min離心1min；棄去收集管，將層析柱安裝在新的收集管上，加入500μL AW1溶液，8 000r／min離心1min；換上新的收集管后，加入500μL AW2溶液，14 000r／min離心3min；再高速空離1min，將層析柱安裝在1.5mL Eppendorf管上，加入50 μL AE溶液，室溫孵育5min，8 000r／min離心1 min。隨機挑選提取的基因組，用Nanodrop 2000紫外分光光度計對其純度和濃度進行測定，基因組DNA樣品置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

引物合成后用滅菌雙蒸水將其稀釋成10 μmol／L，PCR反應體系為25μL。在PCR反應管中加入以下成分：LATaq酶0.25μL；10×LA PCR buffer 2.5μL，dNTP 4μL，EE1 1μL，EE2 1μL，DNA模板1μL，ddH2O 15.25μL。每組反應設陰性對照，以蒸餾水代替基因組DNA。PCR反應條件為94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35個循環(huán)；72℃10min，12℃結束反應。擴增產(chǎn)物通過10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照。

1.2.3 PCR產(chǎn)物連接、克隆及鑒定 PCR陽性產(chǎn)物，利用DNA凝膠回收試劑盒回收純化目的條帶，而后進行連接。連接反應體系為10μL，包括純化的產(chǎn)物3μL，pGEM－T Easy載體1μL，連接酶buffer 5μL，T4DNA連接酶1μL，充分混勻后16℃水浴連接過夜。取10μL連接產(chǎn)物轉化進大腸埃希菌JM109感受態(tài)細胞，加入IPTG（100 mmol／L）4μL，X－gal（20mg／mL）16μL，混勻后涂布于含有氨芐青霉素的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)16h～18h。從平板上挑取單個白色菌落接種于4 mL LB培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)6h。PCR檢測為陽性的菌液樣品送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序。應用DNA Star分子生物學軟件處理獲得的序列，并在 http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi網(wǎng)站上進行比對分析。

1.2.4 相似性比較及系統(tǒng)進化分析 從NCBI中下載相關物種的16SrRNA基因序列，將犬埃里克體（Ehrlichiacanis）（EF011111）作為外群，選擇羊無漿體3株，分別是A.ovisisolate Yuzhong［AJ633050］，A.ovisisolate Jingtai［AJ633049］和A.ovisisolate OVI from South Africa［AF414870］；邊緣無漿體4株，分別是A.marginalestrain Veld［AF414873］，A.marginalestrain Florida［AF309867］，A.marginalestrain St.Maries［AY048816］和A.marginalestrain South Idaho［AF309868］；中央無漿體2株，分別為A.centralestrain vaccine from Australia［AF414868］和A.centralestrain Israel vaccine［AF309869］；另外還有A.bovisisolate R7［JN558828］，A.phagocytophilumclone J4－3－6［AY969014］和本研究中測序獲得的2個克隆，A.ovisisolate XG34和LYG106，共14條序列。采用Mega Align 4.0數(shù)據(jù)軟件處理序列，用鄰近法（NJ）構建16SrRNA基因系統(tǒng)進化樹，并進行多序列的同源性比較。

2 結果

2.1 各地區(qū)蜱的分類及無漿體16SrRNA基因擴增結果

采集的511份饑餓成蜱，經(jīng)形態(tài)學鑒定為2個種，即西藏革蜱（D.everestianus）和銀盾革蜱（D.niveus）。以提取的蜱基因組DNA為模板，采用無漿體屬16SrRNA基因特異性引物對EE1／EE2進行PCR擴增，結果在1 400bp附近擴增出一條特異性的條帶，與預測的目的片段大小一致（圖1）。這批樣品中，共檢出陽性樣品34份，總體感染率為6.7%（34／511）（表1）。將部分陽性樣品中的目的片段進行回收、連接和克隆，將菌液PCR鑒定為陽性的菌液送出測序，得知擴增產(chǎn)物為1 430bp，BLAST結果顯示與羊無漿體同源性較高。

2.2 16SrRNA基因序列同源性比較及系統(tǒng)發(fā)育分析結果

通過PCR方法共檢出陽性樣品34份，但由于其中3個樣品擴增出來的目的產(chǎn)物含量較低，導致連接失敗，最終只獲得31條序列。將這些序列進行比對后，發(fā)現(xiàn)同源性范圍為99.6%～100%。提示我們檢測到的無漿體是單一種，在NCBI中BLAST分析后，證實與羊無漿體關系最近。

圖1 16SrRNA基因片段的PCR擴增結果Fig.1 PCR results of the 16SrRNA gene from field samples and control

表1 西藏蜱樣中羊無漿體的感染率情況Table 1 The infection rate of A.ovis in ticks collected from Tibet

再將本試驗測序獲得的2個克隆序列XG34和LYG106的16SrRNA基因序列與GenBank收錄的A.ovis［AJ633050、AJ633049和 AF414870］，A.marginalestrain Veld［AF414873、AF309867、AY048816和AF309868］，A.centrale［AF414868］和A.centrale［AF309869］，另外還有A.bovis［JN558828］，A.phagocytophilum［AY969014］等序列進行同源性分析，顯示本試驗獲得的克隆與A.ovis同 源 性 最 高，為 99.7% ～99.8%；與A.marginale和A.centrale的同源性為99.1%～99.4%；與A.bovis和A.phagocytophilum同源性為95.9%、96.2%。

用上述14條16SrRNA基因序列構建進化樹，結果顯示XG34和LYG106分離株的16S rRNA基因序列與A.ovis（AJ633049、AJ633050和AF414870）位于同一分支上。A.marginale、A.centrale、A.bovis和A.phagocytophilum分別位于不同的分支上（圖2）。以上數(shù)據(jù)一致表明，本研究中檢測到的病原是羊無漿體。

3 討論

無漿體病是一類重要的自然疫源性疫病。主要病原有嗜吞噬粒細胞無漿體（A.phagocytophilum）、邊緣無漿體、中央無漿體、牛無漿體（A.bovis）和 羊無漿體。該病病原的傳播媒介為硬蜱，研究已證實微小牛蜱（Boophilusmicroplus）、亞東璃眼蜱 （Hyalommaasiaticum）、篦子硬蜱 （Ixodes ricirus）和有紋革蜱 （Dermacentorpictus）可傳播邊緣無漿體，草原革蜱 （D.nuttalli）、銀盾革蜱（D.niveus）、亞東璃眼蜱 （H.asiaticum）和短小扇頭蜱 （Rhipicephaluspurmilio）可傳播羊無漿體［4］，長角血蜱 （Haemaphysalislongicornis）和巨棘血蜱（H.megaspinosa）可傳播牛無漿體［5－7］，全溝硬蜱（Ixodespersulcatus）可傳播嗜吞噬細胞無漿體［8］。羊無漿體廣泛分布于世界各地，盡管致病性不是很強，但會影響?zhàn)B羊業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。本研究應用常規(guī)PCR方法對西藏當雄地區(qū)的蜱樣進行了檢測，發(fā)現(xiàn)呈單一無漿體，即羊無漿體感染，感染率為6.7%。西藏革蜱和銀盾革蜱的感染率分別為6.1%和6.7%，不同蜱種的感染率差異不顯著。從西藏革蜱和銀盾革蜱的基因組中分別擴增到了羊無漿體16SrRNA基因，證明這兩種蜱是該地區(qū)羊無漿體病的潛在傳播媒介。對不同地區(qū)蜱感染無漿體結果分析顯示，不同地區(qū)感染率有較大區(qū)別，其中烏瑪鄉(xiāng)最高，為20.6%（14／68），當雄縣城地區(qū)與龍仁鄉(xiāng)樣品的陽性率較低，分別為5.7%（5／88）和4.2%（15／355）。已知羊無漿體對山羊和綿羊危害較為嚴重，而當雄縣局部地區(qū)蜱綿羊無漿體感染率較高應引起當?shù)孬F醫(yī)工作者的重視。

圖2 利用16SrRNA基因序列構建的無漿體系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Anaplasmaspecies constructed using partial 16SrRNA sequences

無漿體傳統(tǒng)的檢測方法有鏡檢和體外培養(yǎng)，但體外培養(yǎng)不易進行，盡管近年來邊緣無漿體的體外培養(yǎng)取得了一定的進展，但至今尚未有羊無漿體體外培養(yǎng)的報道。鏡檢雖然比較省時省力，易于操作，但對于一些泰勒蟲和巴貝斯蟲混合感染病例，鏡檢較難有效地對病原進行區(qū)分。由于缺乏體外培養(yǎng)系統(tǒng)，缺乏合適的實驗動物模型，也較難用顯微鏡鏡檢地方法準確的區(qū)分病原，把16SrRNA基因引入到了羊無漿體的分類學研究之中能較好的彌補傳統(tǒng)分類學的缺陷。有研究以16SrRNA基因序列合成通用引物，對邊緣無漿體進行了擴增，并提出了用這種方法對邊緣無漿體系統(tǒng)發(fā)生關系研究的可能性，為無漿體病的分子分類學研究提供了依據(jù)。本試驗就是基于這種方法，擴增出了大小為1 430bp的特異性片段，將測序獲得的2個克隆XG34和LYG106的16SrRNA基因序列作為代表序列與國內外報道的11株菌株的16SrRNA基因序列進行同源性及系統(tǒng)進化分析。從進化樹上看出，從西藏地區(qū)檢測到的羊無漿體與國內報道的2株羊無漿體和南非分離到的A.ovisisolate OVI分到了一個大的分支上，并且可區(qū)分邊緣無漿體和中央無漿體，這些結果不但再次證明了該分類標準的應用價值和意義，也證明了16SrRNA在無漿體種內的高度保守性。這與周作勇［2］獲得的結果一致。

該病呈世界性流行，已報道的國家有伊朗、敘利亞、伊拉克、哈薩克斯坦、土庫曼、烏茲別克斯坦和美國等。在我國新疆和布克塞耳蒙古自治縣也發(fā)現(xiàn)有綿羊無漿體病。應用補體結合試驗和病原檢測相結合的方法對甘肅綿羊無漿體病的分布進行了調查，在陜西、甘肅、寧夏和青海四?。▍^(qū)）23個縣的綿羊和山羊中發(fā)現(xiàn)綿羊無漿體病。近年來河南、山東、四川和廣東發(fā)現(xiàn)有該病，給疫區(qū)的養(yǎng)羊業(yè)造成了威脅［9－11］。本研究豐富了我國綿羊無漿體病的流行病學資料，提示西藏地區(qū)也有此病的分布。但本次采樣地點集中在當雄縣，不能代表整個西藏地區(qū)，在西藏地區(qū)開展更大規(guī)模的流行病學調查是在該地區(qū)開展本病研究的當務之急。

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