胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2通路在阿霉素引起的心肌細胞損傷中的作用

張莉莉，賴東平，王秀玉，鄭東誕，郭潤民，沈 寧，陳培熹，馮鑒強

(1.廣東省醫(yī)學科學院，廣東省人民醫(yī)院，廣東省老年醫(yī)學研究所綜合科，廣東廣州 510080;2.江西省龍南縣婦幼保健院內(nèi)科，江西龍南 341700;3.中山大學中山醫(yī)學院生理學教研室，廣東廣州 510080;4.中山大學附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)心血管內(nèi)科，廣東廣州 510080)

臨床上，阿霉素(doxorubicin，DOX)是一種有效的抗癌藥，常被用來治療多種實體惡性腫瘤及白血病［1］，其抗癌作用似乎是劑量依賴的。但是，DOX能引起多種嚴重的副作用，例如，心肌病和充血性心力衰竭等［2－4］，故限制了其在臨床上的應(yīng)用。有研究指出，DOX引起的心肌毒性與氧化應(yīng)激［4－6］及激活腫瘤抑制因子p53蛋白［7］等因素有關(guān)。

近年，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)在 DOX 引起的心肌損傷中的作用引起學者的重視。ERK1/2是絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中的一個重要成員。在心肌細胞，多種生長因子及高滲刺激可激活ERK1/2，這種活化可能與心肌肥大或細胞保護有關(guān)［8－9］。然而，有關(guān)DOX對心肌ERK1/2的作用有3種不同的意見(激活、抑制或無作用)。Esaki等［8］認為，DOX 能抑制心肌細胞內(nèi)ERK1/2的活化，肝細胞生長因子可通過激活ERK通路來保護心肌對抗DOX引起的心肌病。而Lou等［4］則認為，DOX能激活ERK1/2，抗氧化劑能抑制DOX引起的細胞凋亡及ERK1/2的活化。因此，深入探討DOX對心肌細胞ERK1/2活化的影響及ERK1/2在DOX引起的心肌細胞損傷中的作用很有必要。

為此，本研究應(yīng)用DOX處理來源于大鼠胚胎心臟的H9c2心肌細胞以建立細胞損傷模型，旨在探討:(1)DOX對心肌細胞磷酸化(代表激活狀態(tài))ERK1/2表達的影響;(2)DOX對心肌細胞的損傷作用，包括對細胞存活率，氧自由基(reactive oxygen species，ROS)生成，線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)及胱硫醚 γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)表達等的影響;(3)應(yīng)用ERK1/2抑制劑能否保護心肌細胞對抗DOX引起的損傷作用，以便為深入闡明DOX的心肌細胞損傷機制，特別是ERK1/2通路在其中的作用提供新穎的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料DOX、ERK1/2抑制劑 PD-98059(PD)和雙氯熒光素(2'，7'-dichlorfluorescein-diacetate，DCFH-DA)購自美國Sigma Aldrich公司。細胞計數(shù)試劑盒-8(cell counter kit-8，CCK-8)和羅丹明123(rhodamine123，Rh123)購自日本 Dojindo Lab。兔抗大鼠ERK1/2和CSE抗體購自美國Proteintech公司。DMEM-F12培養(yǎng)基和特級胎牛血清購自美國Gibco公司。H9c2心肌細胞由中山大學實驗動物中心提供。

1.2細胞培養(yǎng)及處理H9c2心肌細胞在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)于含有12%特級胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中。用DOX處理H9c2心肌細胞以建立DOX心肌毒性的體外模型。在DOX處理H9c2心肌細胞前用選擇性ERK1/2的抑制劑PD-98059預處理以明確ERK1/2信號通路在DOX心肌毒性及CSE表達中的作用。

1.3細胞存活率的檢測H9c2心肌細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每組4個復孔，約80%融合時，給予不同的處理因素。處理結(jié)束后，每孔加100 μl(1∶10稀釋)CCK-8溶液，輕搖，37℃孵育3 h，用酶標儀(λ=450 nm)記錄各孔的吸光度(optical density，OD)。取4孔OD值的平均數(shù)，按公式計算細胞存活率，細胞存活率/%=處理組OD/對照組OD×100%，重復5次。

1.4細胞內(nèi)ROS含量的檢測按照文獻［10］介紹的方法檢測胞內(nèi)ROS的含量。當細胞生長到約80%融合時，根據(jù)實驗需要給予不同的條件培養(yǎng)基。處理完成后，PBS洗 2次，細胞在 10 μmol·L－1DCFH-DA染液中37℃孵育10 min。在熒光顯微鏡下隨機選取3個不重復區(qū)攝片，用ImageJ 1.41o軟件的Color Histogram模塊分析DCF的平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)，其大小反映ROS的含量。

1.5MMP檢測按照文獻［10］介紹的方法檢測MMP。當細胞生長到約80%融合時，根據(jù)實驗需要給予不同的條件培養(yǎng)基。處理結(jié)束后，用PBS洗2次，在含 100 μg·L－1Rh 123 的無血清培養(yǎng)基中37℃孵育30 min。在熒光顯微鏡下隨機選取3個不重復區(qū)攝片，細胞核周圍綠色的亮點即為攝取了Rh123的線粒體。用ImageJ 1.41o軟件對綠色熒光強度進行半定量分析。

1.6Western blot法檢測蛋白的表達H9c2心肌細胞接種于35 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，約80%融合時，給予不同的處理因素。處理完成后，用預冷的PBS洗2次，加入細胞裂解液，4℃靜置30 min。12 000 r·min－1離心10 min，取上清，采用BCA法進行蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1.5 h。隨后加入兔抗大鼠總(t)-ERK1/2抗體、磷酸化(p)-ERK1/2抗體或CSE抗體，室溫孵育2 h，用TBST洗3次，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h，漂洗3次。增強型化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)顯色后，用 ImageJ 1.41o進行光密度分析，每樣本重復3次。

1.7統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，組間比較采用One-way ANOVA及LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1DOX上調(diào)H9c2心肌細胞內(nèi)p-ERK1/2的表達Fig 1結(jié)果顯示，5 μmol·L－1DOX 處理 H9c2細胞1～6 h呈時間依賴性地增加p-ERK1/2的表達，其中處理3 h時p-ERK1/2的表達開始增加(P＜0.05)，處理6 h時，p-ERK1/2的表達約為正常對照組的2.4 倍(P＜0.01)。5 μmol·L－1DOX 對 t-ERK1/2表達水平無明顯影響。

Fig 1 Effect of DOX on the activation of ERK1/2 in H9c2 cells(n=3)

2.2ERK1/2抑制劑抑制DOX引起的心肌細胞毒性如Fig 2所示，5 μmol·L－1DOX 處理 H9c2細胞24 h具有明顯的心肌細胞毒性，使細胞存活率降低，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。但是，在DOX處理H9c2細胞前30 min，應(yīng)用10 μmol·L－1ERK 1/2 抑制劑 PD-98059 預處理能明顯對抗DOX對細胞存活率的抑制作用(P＜0.05)。10 μmol·L－1PD-98059 本身對 H9c2 細胞存活率無明顯影響。

Fig 2 Effect of ERK1/2 inhibitor on DOX-induced cytotoxicity in H9c2 cells(n=5)

2.3ERK 1/2抑制劑抑制DOX引起的胞內(nèi)ROS生成增多Fig 3顯示，正常對照組的H9c2細胞胞內(nèi) ROS水平較低，5 μmol·L－1DOX 處理 H9c2 細胞2 h可使胞內(nèi)ROS水平明顯升高，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。10 μmol·L－1PD-98059本身對H9c2細胞胞內(nèi)ROS水平無明顯影響，但是PD-98059預處理30 min卻能明顯拮抗DOX對胞內(nèi)ROS生成的促進作用(P＜0.05)。

2.4 ERK1/2抑制劑阻斷DOX對MMP的抑制作用Fig 4結(jié)果顯示，5 μmol·L－1DOX 處理 H9c2細胞24 h可明顯降低MMP，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。10 μmol·L－1ERK1/2抑制劑 PD-98059本身對心肌細胞的MMP無明顯影響，但是 PD-98059預處理30 min能明顯阻斷DOX對MMP的損傷作用(P＜0.05)。

2.5ERK1/2抑制劑拮抗DOX對心肌細胞CSE表達的抑制作用如Fig 5所示，正常H9c2心肌細胞具有一定水平的 CSE表達。但是5 μmol·L－1DOX處理H9c2細胞24 h能明顯抑制CSE表達，使CSE的表達水平約降低為原來的1/2，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。10 μmol·L－1PD-98059本身對H9c2細胞內(nèi)CSE基礎(chǔ)表達水平無明顯影響，然而PD-98059預處理30 min能明顯地拮抗DOX對心肌細胞CSE表達的抑制作用(P＜0.05)。

Fig 3 Effect of ERK1/2 inhibitor on DOX-induced ROS generation in H9c2 cells(n=3)

3 討論

目前，在基礎(chǔ)研究方面，有關(guān)DOX對ERK通路的作用存在3種不同的結(jié)果:激活、抑制、無作用。在H9c2心肌細胞及新生大鼠原代培養(yǎng)的心肌細胞，Liu等［11］觀察到，在DOX引起心肌細胞死亡前，先出現(xiàn)ERK1/2被激活;特異性ERK抑制劑PD-98059能阻斷 DOX引起的心肌細胞凋亡。在小鼠實驗?zāi)Ｐ停骨蛔⑸銬OX能使心肌內(nèi)的p-ERK表達明顯減少［8］。然而，Spallarossa 等［12］在 H9c2 心肌細胞卻沒有觀察到DOX對ERK磷酸化有明顯的作用。

為了進一步明確ERK1/2在DOX引起的心肌損傷中的功能意義，本研究應(yīng)用5 μmol·L－1(接近病人血漿中DOX的峰濃度)DOX處理H9c2心肌細胞1～6 h。Western blot檢測的結(jié)果證實，DOX呈時間依賴性地上調(diào)磷酸化(代表激活)ERK1/2蛋白表達，這與Liu等［11］觀察到的結(jié)果相似，但與其他的研究報道［8，12］不一致。另一方面，本研究觀察到DOX對H9c2心肌細胞具有明顯的損傷作用，表現(xiàn)為使心肌細胞存活率降低，ROS生成增多(反映氧化應(yīng)激)，MMP丟失(反映線粒體功能受損)，上述的研究結(jié)果均與相關(guān)報道［4－6，11］相一致。此外，我們還觀察到DOX能抑制CSE表達。CSE是心肌細胞內(nèi)合成內(nèi)源性硫化氫(H2S)的主要合成酶，H2S被認為是第3種內(nèi)源性氣體信號分子，具有心肌保護作用。由于DOX抑制了CSE表達，從而可能引起心肌細胞內(nèi)源性H2S生成減少。有研究指出，應(yīng)用H2S合成抑制劑抑制了內(nèi)源性H2S生成能減弱缺血預處理對離體心臟及心肌細胞的保護作用［13］。因此，對CSE的抑制可能是DOX損傷心肌細胞的另一機制。Su等［14］也報道，在DOX處理大鼠后可使其血漿及心肌的H2S含量降低。重要的是，本研究證實ERK1/2抑制劑PD-98059能抑制阿霉素對CSE表達的抑制作用，提示ERK1/2通路參與阿霉素對CSE的損傷，這為深入闡明ERK1/2通路在阿霉素心肌毒性的作用提供了新穎的實驗資料。

Fig 4 Effect of ERK1/2 inhibitor on MMP loss induced by DOX in H9c2 cells(n=3)

Fig 5 Effect of ERK1/2 inhibitor on the inhibition of CSE expression induced by DOX in H9c2 cells(n=3)

目前，對ERK1/2與細胞損傷的關(guān)系有不同的意見。有學者認為ERK1/2通路具有心肌保護作用［8］。但是，也有報道指出ERK1/2通路參與DOX對心肌細胞的損傷［11］。最近，Dong 等［15］報道，ERK1/2通路介導化學性低氧對心肌細胞的損傷作用。為了進一步探討ERK1/2在DOX引起的心肌細胞損傷中的作用，本研究在DOX作用心肌細胞前30 min，應(yīng)用選擇性ERK1/2抑制劑PD-98059預處理H9c2心肌細胞。研究結(jié)果表明，ERK抑制劑可分別抑制DOX的心肌毒性，使細胞存活率升高;抑制胞內(nèi)ROS生成增多;拮抗DOX對MMP的抑制作用，提示ERK1/2可能參與DOX對心肌細胞的損傷作用。Liu等［11］的報道支持本實驗結(jié)果。但是，也有人認為，在DOX處理的小鼠，ERK1/2具有保護心肌作用［8］。有關(guān)ERK1/2在DOX引起的心肌損傷中作用不一致的原因可能是多方面的?？赡芘c不同的實驗?zāi)Ｐ?，不同的作用劑量與作用時間，較重要的因素是可能與其他信號通路的活動狀態(tài)有關(guān)［16］。因此，應(yīng)用多種研究模型、研究技術(shù)與方法等進一步探討ERK1/2通路在DOX引起的心肌損傷中的作用，將有助于闡明DOX的心肌損傷機制，也有利于尋找防治DOX心肌毒性的藥物靶點。

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