脂聯(lián)素對大鼠缺血/再灌注心肌細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

郭 佳，肖傳實(shí)，白 瑞，邊云飛

(山西醫(yī)科大學(xué)1.臨床技能實(shí)驗(yàn)培訓(xùn)中心、2.第一醫(yī)院心內(nèi)科、3.第二醫(yī)院心內(nèi)科，山西太原 030001)

缺血心肌在恢復(fù)血流后，引起心肌結(jié)構(gòu)、功能及代謝等方面的進(jìn)一步損傷即心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia and reperfusion injure，MIRI)。研究表明心肌細(xì)胞凋亡可能是心肌細(xì)胞MIRI發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)之一［1－2］，如何減少心肌細(xì)胞凋亡已成為缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。近年來有基礎(chǔ)和臨床研究表明脂聯(lián)素(adiponectin，APN)對 MIRI具有保護(hù)作用［3－4］，但其機(jī)制仍不清楚。本研究通過建立大鼠I/R模型，經(jīng)舌靜脈注射脂聯(lián)素，觀察脂聯(lián)素對I/R心肌梗死面積和心功能的影響，并經(jīng)透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)的變化，TUNEL法觀察心肌細(xì)胞凋亡情況，同時(shí)觀察凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)，探討脂聯(lián)素減輕MIRI的機(jī)制，從而為進(jìn)一步防治MIRI，恢復(fù)心肌細(xì)胞功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與儀器脂聯(lián)素購自Sigma公司，批號:SRP4593;兔抗鼠 Bcl-2、Bax、Caspase-3 多克隆抗體均購自Santa Cruz Biotechnology;細(xì)胞核－胞質(zhì)－胞膜制備試劑盒:普利萊基因技術(shù)有限公司。細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒(In Situ Cell Death Detection Kit，POD)購自Roche公司。動(dòng)物人工呼吸機(jī):成都泰盟科技有限公司，HX-100E;多道生理信號采集處理系統(tǒng)RM6240BD購自成都儀器廠;電泳儀:北京六一儀器廠;透射電鏡:JEM-CX100;激光掃描共焦顯微鏡:日本，Olympus FV1000。

1.1.2動(dòng)物及分組♂健康SD大鼠48只，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(清潔級)，體質(zhì)量200 g～220 g，隨機(jī)分為3組，每組16只。即假手術(shù)組(sham group)、缺血/再灌注組(I/R group)、脂聯(lián)素預(yù)處理組(APN+I/R group)。假手術(shù)組與I/R組于缺血前30 min經(jīng)舌靜脈給予生理鹽水，脂聯(lián)素預(yù)處理組于缺血前30 min經(jīng)舌靜脈給予脂聯(lián)素(1 μg·kg－1)后行I/R。各組內(nèi)隨機(jī)選取8只大鼠用于心肌梗死面積的測定，另外8只大鼠用于監(jiān)測血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)并于再灌注3 h后取左心室游離壁和心尖部心肌組織做各項(xiàng)指標(biāo)檢測。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型制備戊巴比妥鈉麻醉，仰臥固定。記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖，氣管插管，小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，經(jīng)胸骨左緣第2～3肋間打開胸腔暴露心臟，于左心耳根部下方2 mm處用5/0線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支，將絲線兩端穿過一根聚乙烯小管，止血鉗夾持細(xì)管，結(jié)扎線以下心肌組織顏色變暗，在Ⅱ?qū)?lián)心電圖見R波明顯增大伴ST段即刻抬高，說明心肌已缺血。30 min后予以再灌注，以缺血區(qū)轉(zhuǎn)紅，相關(guān)導(dǎo)聯(lián)ST段明顯回落為再通標(biāo)志，并持續(xù)3 h。

1.2.2心肌梗死面積的測定大鼠經(jīng)再灌注3 h后再次原位結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈，經(jīng)頸動(dòng)脈注入伊文氏藍(lán)。取出心臟，切片，TTC染色，藍(lán)色為未缺血區(qū)域、紅色為缺血區(qū)域。將紅色的缺血心肌片置于TTC磷酸緩沖液染色。缺血但未梗死心肌染成紅色，梗死心肌則為灰白色，稱量缺血未梗死心肌和梗死心肌濕重。心肌缺血范圍:缺血心肌面積/左心室面積(AAR/LV)來計(jì)算;心肌梗死范圍:壞死區(qū)/危險(xiǎn)區(qū)面積(NEC/AAR)來表示。

1.2.3血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的測定大鼠經(jīng)頸動(dòng)脈插管至左心室，以生物信號采集系統(tǒng)監(jiān)測記錄各組左心室舒張末期壓(LVEDP)、左心室壓力最大上升(+dp/dtmax)、下降速度(－dp/dtmax)及心率(HR)。

1.2.4心肌超微結(jié)構(gòu)觀察迅速取下心尖部心肌組織切成1 mm3，戊二醛磷酸鹽緩沖液、餓酸各固定2 h，脫水、包埋、切片、醋酸雙氧鈾、枸櫞酸雙重染色，透射電鏡下觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.2.5心肌細(xì)胞凋亡測定采用TUNEL凋亡試劑盒檢測各組心肌組織中的凋亡細(xì)胞，激光掃描共焦顯微鏡下觀察，TUNEL陽性細(xì)胞核呈綠色熒光。

1.2.6Western blot法測定Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)提取組織蛋白，使用BCA Protein Assay kit(Beyotime，Haimen，China)測定蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液、加熱變性蛋白、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)、電轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維膜、BSA封閉、兔抗鼠 Bcl-2(1 ∶200)、Bax(1 ∶200)、Caspase-3(1∶200)、β-actin 多克隆抗體(Santa Cruz CA，USA)及二抗孵育，化學(xué)發(fā)光劑顯色。Gel Imaging System(Bio-Rad)進(jìn)行灰度分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料采用進(jìn)行描述，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)處理，多組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1心肌梗死面積假手術(shù)組心肌缺血范圍為0，缺血/再灌注組與脂聯(lián)素組AAR/LV差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說明實(shí)驗(yàn)操作手法基本一致，排除了由此而造成的誤差。與I/R組比較，APN+I/R組NEC/AAR明顯下降(P＜0.05)。見Tab 1。

2.2心功能指標(biāo)與假手術(shù)組比較，I/R組LVEDP升高、+dp/dtmax和 －dp/dtmax降低(P＜0.05);與 IR組比較，APN+I/R組的LVEDP降低、+dp/dtmax和－dp/dtmax明顯升高(P＜0.05)。見Tab 2。

2.3各組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察假手術(shù)組線粒體外膜完整，峭密集，排列整齊，線粒體基質(zhì)致密，內(nèi)有電子致密顆粒。胞核呈橢園形，異染色質(zhì)呈連續(xù)薄層依附在核膜內(nèi)側(cè)面。I/R組出現(xiàn)廣泛的線粒體損傷。雖然大多數(shù)線粒體外膜連續(xù)，但基質(zhì)明顯變淡，峭排列紊亂。胞核皺縮，染色質(zhì)凝集。脂聯(lián)素預(yù)處理組心肌超微結(jié)構(gòu)除某些區(qū)域的線粒體有改變外，與對照無明顯區(qū)別(Fig 1)。

Tab 1 The infarct size of myocardium at the end of reperfusion(±s，n=8)

Tab 1 The infarct size of myocardium at the end of reperfusion(±s，n=8)

*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs I/R

Group AAR/LV NEC/AAR Sham 0 0 I/R 0.55 ±0.03* 0.41 ±0.03*APN+I/R 0.53 ±0.04* 0.36 ±0.05*#

Tab 2 Hemodynamics(±s，n=8)

Tab 2 Hemodynamics(±s，n=8)

*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs I/R

Group LVEDP/kPa+dp/dtmax/kPa·s－1－dp/dtmax/kPa·s －1 Sham 0.43 ±0.12 1038.82 ±159.30 －901.68 ±132.53 I/R 0.96 ±0.26* 673.7 ±115.2* －609.17 ±126.33*APN+I/R 0.51 ±0.24*# 961.34 ±130.30*# －766.20 ±141.18*#

Fig 1 The ultrastructural change of myocardial tissue in groups(×12 000)

2.4各組心肌組織中的細(xì)胞凋亡情況TUNEL染色結(jié)果顯示:Sham組未見明顯細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，I/R組心肌組織可見大量凋亡細(xì)胞，APN+I/R組凋亡細(xì)胞較I/R組明顯減少(Fig 2)。

Fig 2 Effect of adiponectin on apoptosis in cardiac tissues of rats in various groups by TUNEL staining(×400)

2.5心肌組織凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)I/R組較 Sham 組Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)均上調(diào)，但以Bax升高為主，而脂聯(lián)素預(yù)處理可明顯增加心肌組織Bcl-2表達(dá)，降低Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)(Fig 3)。

Fig 3 Western blot analysis of Bcl-2，Bax and Caspase-3 in rat cardiomyocyte(±s，n=3)

3 討論

近年來研究表明，在冠心病、高血壓、心肌梗死的患者中，血漿脂聯(lián)素水平明顯低于正常人［5－6］，脂聯(lián)素具有心血管系統(tǒng)保護(hù)作用［7］。在前期的實(shí)驗(yàn)中，我們已經(jīng)證實(shí)脂聯(lián)素通過減少肌酸激酶、升高SOD和NO活力有效減輕心肌I/R損傷［8－9］。本研究通過舌靜脈注射脂聯(lián)素，建立大鼠在體I/R模型，觀察脂聯(lián)素對大鼠缺血/再灌注所致心肌細(xì)胞凋亡的影響，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

MIRI是急性冠脈綜合征經(jīng)皮穿刺冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)及心臟移植術(shù)后心功能不全和心律失常的主要病理基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示再灌注3 h后，脂聯(lián)素預(yù)處理組大鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)明顯改善;心肌梗死區(qū)面積較I/R組明顯減小。近年來已有基礎(chǔ)和臨床實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)，細(xì)胞凋亡可能是心肌細(xì)胞MIRI發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)之一，是心肌梗死早期細(xì)胞死亡的主要方式，抑制細(xì)胞凋亡便能明顯縮小I/R所致心肌梗死的面積［1－2］。TUNEL方法是定量檢測細(xì)胞凋亡的一種技術(shù)手段［10］，本文經(jīng) TUNEL染色，I/R組可見大量凋亡細(xì)胞，脂聯(lián)素明顯減少I/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。透射電鏡心肌超微結(jié)構(gòu)也充分顯示了這一點(diǎn)。脂聯(lián)素預(yù)處理可明顯逆轉(zhuǎn)I/R所致的心肌細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、線粒體等結(jié)構(gòu)的改變。以上結(jié)果提示，脂聯(lián)素預(yù)處理對在體大鼠MIRI具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用和其抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

細(xì)胞凋亡的發(fā)生受到細(xì)胞內(nèi)凋亡調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控，這些凋亡調(diào)節(jié)蛋白分為促凋亡基因(Bax、Fas等)和抗凋亡基因(Bcl-2等)兩大類。在調(diào)控凋亡的基因中，Bcl-2基因家族是目前較公認(rèn)與凋亡密切相關(guān)的基因［11］，其中Bcl-2具有抗心肌細(xì)胞凋亡作用，而Bax可以促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白是以異二聚體的形式存在，阻止Bax插入線粒體外膜，保護(hù)線粒體電勢梯度，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的自穩(wěn)狀態(tài)和氧化還原狀態(tài)來抑制凋亡。因此常用兩種蛋白表達(dá)比率(Bcl-2/Bax)表示心肌細(xì)胞凋亡的程度［12］。研究表明，半胱天冬酶家族(Caspases)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)者和執(zhí)行者，其中Caspase-3作為細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性蛋白酶，直接導(dǎo)致凋亡細(xì)胞解體，并包裹形成凋亡小體［13］。Bcl-2抑制細(xì)胞色素C的釋放，阻斷上游Caspase蛋白酶的激活，抑制細(xì)胞的凋亡。Bax蛋白作為線粒體膜上離子通道的組成成分，使細(xì)胞色素C得以穿過線粒體膜，激活Caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本文通過 Western blot檢測發(fā)現(xiàn):I/R組 bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，但以Bax升高更為明顯，Bcl-2/Bax比值明顯降低;而脂聯(lián)素預(yù)處理可明顯抑制I/R誘導(dǎo)的Bax及Caspase-3升高，增加Bcl-2表達(dá)，使Bcl-2/Bax比值明顯升高(P＜0.05)。因此，脂聯(lián)素抑制心肌I/R損傷引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與下調(diào) Bax、Caspase-3和上調(diào)Bcl-2的蛋白表達(dá)，升高Bcl-2/Bax比值有關(guān)，但它減輕I/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，還需要進(jìn)一步的深入研究。

綜上所述，心肌I/R過程中細(xì)胞凋亡明顯增多，脂聯(lián)素可明顯減輕I/R損傷，其機(jī)制與減輕心肌細(xì)胞凋亡，下調(diào)Bax、Caspase-3水平，上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2水平，提高Bcl-2/Bax比值有關(guān)。因此，給予外源性的脂聯(lián)素可能成為治療I/R損傷的一種新途徑。

［1］史婷婷，白建平，梁月琴，等.芹菜素對大鼠缺血/再灌注心肌細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)的影響［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(5):666 －71.

［1］Shi T T，Bai J P，Liang Y Q，et al.Effect of apigenin on the cardiomyocyte apoptosis in rats with ischemia and reperfusion and the expression of Bcl-2，Bax，Caspase-3［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(5):666－71.

［2］Jiang C M，Han L P，Li H Z，et al.Calcium sensing receptors induce apoptosis in cultured neonatal rat ventricular cardiomyocytes during simulated ischemia/reperfusion［J］.Cell Biol Int，2008，32(7):792－800.

［3］Goldstein B J，Scalia R G，Ma X L.Protective vascular and myocardial effects of adiponectin［J］.Nat Rev Cardiol，2009，6(1):27－35.

［4］Yang Z，Berr S S，Gilson W D，et al.Simultaneous evaluation of infarct size and cardiac function in intact mice by contrast-enhanced cardiac magnetic resonance imaging reveals contractile dysfunction in noninfarcted regions early after myocardial infarction［J］.Circulation，2004，109(9):1161 －7.

［5］Kawanami D，Maemura K，Takeda N，et al.Direct reciprocal effects of resistin and adiponectin on vascular endothelial cells:a new insight into adipocytokine endothelial cell in teractions［J］.Biochem Biophys Res Commun，2004，312(2):415－9.

［6］Tao L，Gao E，Jiao X Y，et al.Adiponectin cardioprotection after myocardial ischemia/reperfusion involves the reduction of oxidative/nitrative stress［J］.Circulation，2007，115:1408 －16.

［7］Takahashi T，Saegusa S，Sumino H，et al.Adiponectin replacement therapy attenuates myocardial damage in leptindeficient mice with viral myocarditis［J］.J Int Med Res，2005，33:207 －14.

［8］陳 君，邊云飛，郝小燕，肖傳實(shí).不同濃度脂聯(lián)素通過減輕氧化應(yīng)激損傷保護(hù)缺血/再灌注心?。跩］.中國動(dòng)脈硬化雜志，2010，18(11):857 －60.

［8］Chen J，Bian Y F，Hao X Y，Xiao C S.Protective effect of different concentrations of adiponectin on ischemia reperfusion myocardium by relieve oxidative stress［J］.Chin J Arterioscl，2010，18(11):857－60.

［9］陳 君，邊云飛，劉 釗，肖傳實(shí).脂聯(lián)素對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)研究［J］.中國藥物與臨床，2011，11(2):154－5.

［9］Chen J，Bian Y F，Liu Z，Xiao C S.Research of adiponectin’s protective effect on ischemia reperfusion injury［J］.Chin Remed Clin，2010，11(2):154 －5.

［10］姚玲玲，黃曉偉，朱依純.離體和在體大鼠心肌細(xì)胞凋亡模型的建立［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(6):879－81.

［10］Yao L L，Huang X W，Zhu Y C.Establishment of thein vitroandin vivocardiomyocyte apoptosis model［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(6):879 －81.

［11］Lockshin R A.Programmed cell death:history and future of a concept［J］.J Soc Biol，2005，199(3):169 － 73.

［12］Gustafsson A B，Gottlieb R A.Bcl-2 family members and apoptosis，taken to heart［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2007，292(1):C45－51.

［13］李 琴，郭云良，李 震，徐新穎.胡黃連苷Ⅱ?qū)Υ笫竽X缺血/再灌注損傷Caspase-3和PARP表達(dá)的影響［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(3):342 －5.

［13］Li Q，Guo Y L，Li Z，Xu X Y.The interference of picrosideⅡ on the expressions of Caspase-3 and PARP following cerebral ischemia reperfusion injury in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(3):342－5.