毛果楊全基因組磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員序列分析

王 策，秦靜靜，甘紅豪，李 紅，羅志斌，3

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一類廣泛存在于微生物、植物及動(dòng)物膜系統(tǒng)中主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)磷酸根的載體蛋白。磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分為PHT和PHO等2類，其中PHO是PHT在進(jìn)化過程中形成的突變體[1]。在不同植物中，PHT的亞家族數(shù)不盡相同，如水稻Oryza sativa具有PHT1，PHT2和PHT3[2]，而擬南芥Arabidopsis thaliana具有6個(gè)PHT亞家族[1]。PHO在序列和功能上與PHT有較大差別，PHO具有PHO1和PHO2亞家族。PHT1亞家族為高親和力的磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，位于細(xì)胞膜上，負(fù)責(zé)根系對(duì)土壤磷的吸收，是研究得最為深入的植物磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。其他PHT亞家族蛋白在不同物種中則具有不同的亞細(xì)胞定位，并執(zhí)行不同的功能。以低親和力的磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PHT2為例，擬南芥的PHT2-1位于細(xì)胞膜上負(fù)責(zé)根細(xì)胞的磷酸根跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[3]，而馬鈴薯Solanum tuberosum的PHT2-1位于質(zhì)體膜上，負(fù)責(zé)質(zhì)體與細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)之間的磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)[4]。PHO中的PHO1主要負(fù)責(zé)將磷由根系薄壁細(xì)胞載入木質(zhì)部運(yùn)向地上部，PHO2主要負(fù)責(zé)磷進(jìn)入韌皮部向根系運(yùn)輸[5]。毛果楊Populus trichocarpa的全基因組測(cè)序已經(jīng)完成，數(shù)據(jù)庫Populus trichocarpa v1.1（http：//genome.jgi-psf.org/Poptr1_1/Poptr1_1.home.html）公布了全部序列。此后，在第1次測(cè)序基礎(chǔ)上，進(jìn)行了第2次補(bǔ)充測(cè)序。毛果楊全基因組最新數(shù)據(jù)已包含在數(shù)據(jù)庫Phytozome v7.0（http：//www.phytozome.net/poplar）中[6]。目前，有關(guān)磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究多集中在酵母Saccharomyces cerevisiae以及擬南芥、水稻和番茄Solanum lycopersicum等1年生草本植物中，木本植物中磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的報(bào)道比較少見，而有關(guān)木本植物磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)研究的報(bào)道尚未見到。Martin[7]曾對(duì)毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族特征及其表達(dá)模式進(jìn)行過初步研究，通過試驗(yàn)對(duì)其中的13個(gè)基因模型進(jìn)行了鑒定與命名，包括11個(gè)PHT1亞家族成員和2個(gè)PHT2亞家族成員。然而，這只是毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的部分成員，并且Martin的研究未涉及其生物信息學(xué)特征。因此，有必要對(duì)毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，為后續(xù)的試驗(yàn)分析與鑒定提供理論基礎(chǔ)。本研究以毛果楊基因組數(shù)據(jù)庫中檢索到的磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列為切入點(diǎn)，獲得毛果楊全基因組中磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的成員信息，利用數(shù)據(jù)庫及生物信息學(xué)軟件CLUSTALX，GeneDOC等對(duì)這些序列進(jìn)行剔除和多重序列比對(duì)，并利用MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)樹的方法，建立了毛果楊全基因組中磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹。此外，還對(duì)部分磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行了理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位的計(jì)算機(jī)分析，最后還通過軟件分析預(yù)測(cè)了部分磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域以及三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)等。本研究可豐富毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族信息，為毛果楊的磷素吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族序列的獲取

在JGI的毛果楊全基因組數(shù)據(jù)庫Populus trichocarpa v1.1中，以“Phosphate Transporter”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，可以獲得Phosphate Transporter基因模型。根據(jù)其他生物中磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列的長(zhǎng)度，剔除長(zhǎng)度不在400～700個(gè)氨基酸之間的序列，同時(shí)，對(duì)比它們的基因座位，只保留基因座位不同的模型。之后，將這些序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中進(jìn)行BLAST，查看相似序列蛋白質(zhì)在其他植物中的功能，將與磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)功能不相關(guān)的基因模型剔除。最后，將保留下來的序列導(dǎo)入最新的毛果楊全基因組數(shù)據(jù)庫Phytozome v7.0中進(jìn)行BLAST，尋找其他可能的蛋白序列。

1.2 毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的系統(tǒng)發(fā)育與保守序列分析

在獲取的毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列的基礎(chǔ)上，以“Phosphate Transporter”為關(guān)鍵詞，在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫中搜索擬南芥、水稻和酵母等模式生物的磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列。將獲取的序列導(dǎo)入CLUSTAL X2.0軟件中進(jìn)行多重序列比對(duì)，并將結(jié)果導(dǎo)入到序列分析軟件MEGA5中查看序列相似度。同時(shí)利用MEGA5中的CLUSTALW程序進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并對(duì)生成的發(fā)育樹進(jìn)行1000 次抽樣的Bootstrap 校正[8]。 利用 MEME 在線服務(wù)器（http：//meme.nbcr.net/meme4_6_0/cgi-bin/meme.cgi），分析毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的保守基序，基序長(zhǎng)度設(shè)為介于6～200個(gè)氨基酸之間，基序最大數(shù)目設(shè)為15[9]。

1.3 毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)分析及跨膜區(qū)預(yù)測(cè)

以毛果楊全基因組數(shù)據(jù)庫中已命名的PtrPHT1-1，PtrPHT1-9和PtrPHT2-1以及通過NCBI數(shù)據(jù)庫初步確認(rèn)的PHO1亞家族成員PtrPHO1-N1為研究對(duì)象，利用瑞士生物信息學(xué)研究所提供的ProtParam（http：//expasy.org/tools/protparam.html）程序，分別對(duì)上述4種蛋白質(zhì)的氨基酸殘基數(shù)目、組成、相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)及穩(wěn)定性等理化性質(zhì)進(jìn)行了在線分析[10]。利用瑞士生物信息學(xué)研究所提供的ProtScale（http：//expasy.org/tools/protscale.html）程序和斯德哥爾摩大學(xué)理論化學(xué)蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)服務(wù)器Topred 2（http：//www.sbc.su.se/～erikw/toppred2），在線預(yù)測(cè)這4種蛋白質(zhì)的親/疏水性，并通過后者同時(shí)預(yù)測(cè)跨膜蛋白跨膜區(qū)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)[10-11]。

1.4 毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用英國(guó)倫敦大學(xué)帝國(guó)理工學(xué)院生物信息學(xué)小組創(chuàng)建的PHYRE2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre）服務(wù)器，通過折疊識(shí)別法預(yù)測(cè)PtrPHT1-1，PtrPHT1-9，PtrPHT2-1和PtrPHO1-N1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)[12]，服務(wù)器自動(dòng)在PDB蛋白晶體庫中搜索匹配度最高的折疊子結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)上預(yù)測(cè)出蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，并同時(shí)給出蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果。最后，利用Raswin軟件查看其三維結(jié)構(gòu)。

1.5 毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的亞細(xì)胞定位分析

WoLF PSORT是一種常用的蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)工具，它根據(jù)氨基酸組成和iPSORT等特征來分析生物體中蛋白序列的亞細(xì)胞定位。將PtrPHT1-1，PtrPHT1-9，PtrPHT2-1和PtrPHO1-N1蛋白序列導(dǎo)入在線分析程序（http：//wolfpsort.seq.cbrc.jp），按照Horton等[13]的分析方法，對(duì)毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族序列

通過毛果楊全基因組數(shù)據(jù)庫中的詳細(xì)注釋對(duì)檢索結(jié)果進(jìn)行篩選，并利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST，最后從檢索到的9763個(gè)磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因模型中篩選出31個(gè)基因模型（表1）。其中13個(gè)基因模型已被Martin[7]注明家族歸屬并命名。另有5個(gè)基因模型通過在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST，初步確定為PHO1亞家族蛋白序列，分別命名為PtrPHO1-N1～PtrPHO1-N5，還有2個(gè)基因模型雖然在NCBI數(shù)據(jù)庫的PHO1亞家族中沒有明確的對(duì)應(yīng)物，但其序列與PtrPHO1亞家族的5個(gè)基因高度相似，因此，將其命名為PtrPHO1-N6和PtrPHO1-N7。對(duì)于另外11個(gè)數(shù)據(jù)庫中未注明家族歸屬的蛋白模型，也跟據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹的亞家族劃分，分別命名為PtrPHT1-N1，PtrPHT1-N2及PtrPHO2-N1～PtrPHO2-N9。由表 1中所列基因座位可知，毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因零散分布于整個(gè)基因組，其中也有不少多種蛋白連鎖在同一染色體上的情況。如PtrPHT1-1，PtrPHT2-1，PtrPHO1-N2，PtrPHO1-N3和PtrPHO1-N4連鎖在LG_X上；在LG_I，LG_II，LG_V，LG_VIII，LG_IX和scaffold_273染色體上也有磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因連鎖的情況。

2.2 毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的系統(tǒng)發(fā)育與保守序列

由構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）可見：毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族可分為PHT和PHO等2個(gè)亞家族，而PHT和PHO又可進(jìn)一步分為PHT1和PHT2以及PHO1和PHO2亞家族。PHT1亞家族中包含了11條數(shù)據(jù)庫中已命名的序列和2條未命名序列PtrPHT1-N1和PtrPHT1-N2；而PHT2亞家族中只有2條已命名序列。PHO1亞家族包含7個(gè)成員；PHO2亞家族共有9個(gè)成員。

表1 毛果楊中磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員及其基因組位置Table1 Family members of phosphate transporters and their genome locations in Populus trichocarpa

同源性比較發(fā)現(xiàn)：毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白各亞家族之間同源性較低，均為10%左右；而同一亞家族內(nèi)各成員同源性相對(duì)較高，以成員數(shù)量較多的PHT1亞家族為例，該亞家族成員可按序列相似性劃分為兩部分。這兩部分成員間的相似性為40%～60%，而各部分內(nèi)成員的相似性很高，為90%左右。這說明毛果楊中不同亞家族磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能在很早以前就由于各種原因而彼此分開，并向著各自的方向進(jìn)化，而后續(xù)進(jìn)化過程中，各亞家族內(nèi)的分化不顯著。

從毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)可知，PHT1亞家族成員內(nèi)含子數(shù)量較少，除PtrPHT1-N1外，最多只有一個(gè)內(nèi)含子；PHT2亞家族的2個(gè)成員各有2個(gè)內(nèi)含子；而2個(gè)PHO亞家族成員內(nèi)含子數(shù)量均較多，且其數(shù)目有一定的差異。由此可見：PHT的基因結(jié)構(gòu)較PHO保守。

圖1 毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹及其基因外顯子∕內(nèi)含子結(jié)構(gòu)圖Figure1 Phylogenetic tree and the exon/intron structures of phosphate transporters in Populus trichocarpa

毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白保守基序的預(yù)測(cè)結(jié)果如圖2所示。發(fā)現(xiàn)PHT1亞家族的保守性較高，具有保守基序1～4和保守基序6，而蛋白PtrPHT1-1～PtrPHT1-7以及PtrPHT1-N1和PtrPHT1-N2還同時(shí)具有保守基序5。這也進(jìn)一步驗(yàn)證了之前通過MEGA5的比對(duì)，按序列相似性將PHT1亞家族分為兩部分這一結(jié)論。然而，PtrPHT1-N2不含家族內(nèi)其他成員中分別位于序列首尾的基序1和基序6，是PHT1亞家族中的一個(gè)例外。PHT2亞家族共用基序2，4和7，并且基序2在序列末尾各有一段重復(fù)，因此PHT2亞家族的保守性也較高。PHO1亞家族主要包含基序8～13等，其中基序8，9和基序11～13為該亞家族所特有。PHO2亞家族主要包含基序6，7，10，14和15等，其中基序7，14和15為該亞家族所特有。PHO的保守性較PHT小，但PHO1和PHO2亞家族中均有部分成員的序列也具有很高的相似性。

在毛果楊與其他模式生物的磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）中發(fā)現(xiàn)，毛果楊PHT1亞家族與擬南芥、水稻同亞家族的同源性均高于60%，且部分成員同源性可達(dá)80%以上，而與各物種PHT2亞家族的同源性低于20%，與各物種PHO亞家族的同源性低于10%。毛果楊PHT2亞家族也只與擬南芥、水稻的PHT2亞家族同源性較高，為70%～80%，與其他序列同源性均低。毛果楊PHO1亞家族與擬南芥、水稻PHO1亞家族同源性為50%～60%，而毛果楊PHO1和PHO2亞家族與酵母磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源性均低于10%。由此可見，磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同亞家族成員在物種內(nèi)及物種間的同源性都較高，而不同亞家族成員無論在物種內(nèi)還是物種間同源性均較低。

圖2 毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白保守基序示意圖Figure2 Conserved motifs of phosphate transporters in Populus trichocarpa

2.3 毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)及跨膜區(qū)

PtrPHT1-1，PtrPHT1-9，PtrPHT2-1和PtrPHO1-N1的基本理化參數(shù)預(yù)測(cè)結(jié)果（表2）表明，4種蛋白的理論等電點(diǎn)均偏堿性，說明其氨基酸序列中帶正電的氨基酸殘基數(shù)多于帶負(fù)電的氨基酸殘基數(shù)，這可能與膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能相關(guān)。4種蛋白的總平均疏水性均為正值，表明它們均為疏水性蛋白質(zhì)。其中，PtrPHT2-1疏水性最強(qiáng)，PtrPHO1-N1疏水性最弱，PtrPHT1-1和PtrPHT1-9疏水性近似。此外，4種蛋白的穩(wěn)定系數(shù)差別不大，并且都相對(duì)穩(wěn)定，這表明該類蛋白可能較適于進(jìn)行體外試驗(yàn)。

PtrPHT1-1，PtrPHT1-9，PtrPHT2-1和PtrPHO1-N1的親/疏水性分析結(jié)果如圖4所示。圖中正值越大表示疏水性越強(qiáng)，負(fù)值越大表示親水性越強(qiáng)，因此，PtrPHT1-1，PtrPHT1-9和PtrPHT2-1均有12個(gè)疏水性區(qū)域，而PtrPHO1-N1的疏水區(qū)明顯偏少，只有6處。這表明與3種PHT蛋白相比，在進(jìn)化上Ptr-PHO1-N1可能發(fā)生了較大程度的變異，導(dǎo)致蛋白質(zhì)整體疏水性降低，疏水性區(qū)域減少，這一結(jié)論與蛋白質(zhì)理化參數(shù)分析結(jié)果一致。此外，還利用ProtScale軟件的Kyte&Doolittle算法（K-D法）對(duì)4種蛋白進(jìn)行了親/疏水性分析[10]，結(jié)果與此一致。對(duì)PtrPHT1-1，PtrPHT1-9，PtrPHT2-1和PtrPHO1-N1進(jìn)行的跨膜區(qū)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果（圖5）與圖4相對(duì)應(yīng)，疏水性大于1.0的片段可確定為跨膜區(qū)，介于0.6～1.0的片段為疑似跨膜區(qū)。由圖5可知：PtrPHT1-1和PtrPHT2-1具有12個(gè)跨膜域，而PtrPHT1-9和PtrPHO1-N1中各有1個(gè)疑似跨膜域，PtrPHT1-9具11個(gè)跨膜域，PtrPHO1-N1具有5個(gè)跨膜域。預(yù)測(cè)結(jié)果同時(shí)顯示，4種跨膜蛋白的C端以及PtrPHT1-1和PtrPHT2-1的N端 都位于細(xì)胞膜的胞質(zhì)一側(cè)，而PtrPHT1-9和PtrPHO1-N1的N端可能也位于細(xì)胞膜的胞質(zhì)一側(cè)。其中PtrPHT1-1和PtrPHT1-9的預(yù)測(cè)結(jié)果與Karandashov[14]報(bào)道的植物PHT1亞家族的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)一致；對(duì)PtrPHT2-1的預(yù)測(cè)結(jié)果也符合Raghothama[15]對(duì)AtPHT2-1跨膜域結(jié)構(gòu)的闡述。而有關(guān)植物PHO的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)未見文獻(xiàn)報(bào)道。

表2 毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PtrPHT1-1，PtrPHT1-9，PtrPHT2-1和PtrPHO1-N1的理化參數(shù)Table2 Physical and chemical characteristics of PtrPHT1-1， PtrPHT1-9， PtrPHT2-1 and PtrPHO1-N1 in Populus trichocarpa

圖3 磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族在幾種模式生物中的系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure3 Phylogenetic tree of phosphate transporters in several model plants

2.4 毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)

PtrPHT1-1，PtrPHT1-9，PtrPHT2-1和PtrPHO1-N1的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如表 3。4種蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組分中，α-螺旋所占比例最高，均超過70%；無規(guī)卷曲和β-折疊所占比例較小。因此，4種蛋白質(zhì)均屬于全α型蛋白質(zhì)（α-螺旋所占比例大于45%）[16]，是跨膜蛋白的主要類型。

PtrPHT1-1，PtrPHT1-9，PtrPHT2-1和PtrPHO1-N1三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果如圖6所示。PtrPHT1-1和PtrPHT1-9的折疊子模型為d1pw4a，是大腸埃希菌Escherichia coli中的甘油-3-磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（glycerol-3-phosphate transporter）家族成員。該折疊子與PtrPHT1-1和PtrPHT1-9的匹配性較好，E值分別為1.2e-26和2e-26，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度均為100%；PtrPHT2-1和PtrPHO1-N1的折疊子模型為d2cfqa1，是大腸埃希菌乳糖透性酶（lactose permease）家族成員。該折疊子與PtrPHT2-1和PtrPHO1-N1的匹配性也較好，E值分別為7.8e-06和0.036，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度均為95%。因此，對(duì)4種蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果較準(zhǔn)確。

圖4 毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 PtrPHT1-1，PtrPHT1-9，PtrPHT2-1和PtrPHO1-N1的親/疏水性分析結(jié)果圖Figure4 Analysis of hydrophilicity/hydrophobicity of PtrPHT1-1， PtrPHT1-9， PtrPHT2-1 and PtrPHO1-N1 in Populus trichocarpa

圖5 毛果楊磷酸根運(yùn)蛋白PtrPHT1-1，PtrPHT1-9，PtrPHT2-1和PtrPHO1-N1的跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果圖Figure5 Transmembrane topology of PtrPHT1-1， PtrPHT1-9， PtrPHT2-1 and PtrPHO1-N1 in P.trichocarpa

圖6表明：它們均為主要由α-螺旋構(gòu)成的全α型蛋白質(zhì)。此類型的跨膜蛋白中，α-螺旋一般也就是其跨膜區(qū)[16]。PtrPHT1-1，PtrPHT1-9和PtrPHT2-1的α-螺旋均為12個(gè)，這也與圖5中的結(jié)果相一致。而PtrPHO1-N1的α-螺旋數(shù)略少于3種PHT蛋白，為10個(gè)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，PtrPHO1-N1中的α-螺旋長(zhǎng)度較3種PHT蛋白短，根據(jù)之前預(yù)測(cè)的PtrPHO1-N1含有5～6個(gè)跨膜域可推測(cè)，PtrPHO1-N1中的部分α-螺旋可能由于長(zhǎng)度過短、疏水性不足而無法形成跨膜區(qū)。根據(jù)前面對(duì)4種蛋白質(zhì)各種特性的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，可以認(rèn)定本試驗(yàn)對(duì)4種毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性較高。

表3 毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PtrPHT1-1，PtrPHT1-9，PtrPHT2-1和PtrPHO1-N1的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Table3 Secondary structures of PtrPHT1-1， PtrPHT1-9， PtrPHT2-1 and PtrPHO1-N1 in Populus trichocarpa

2.5 毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的亞細(xì)胞定位

PtrPHT1-1，PtrPHT1-9，PtrPHT2-1和PtrPHO1-N1的亞細(xì)胞定位分析結(jié)果（表4）表明：PtrPHT1-1，PtrPHT1-9和PtrPHO1-N1位于質(zhì)膜上，參與細(xì)胞對(duì)磷酸根的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)。PtrPHT2-1可能定位于質(zhì)膜、液泡膜或高爾基體膜，若定位于液泡膜，可能說明植物體利用某些磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，將吸收的磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡中，暫時(shí)儲(chǔ)存磷素營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)磷濃度的穩(wěn)態(tài)；若定位于高爾基體膜，其功能可能是將胞質(zhì)中的磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，用于各類蛋白質(zhì)合成后的磷酸化修飾。

圖6 毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PtrPHT1-1，PtrPHT1-9，PtrPHT2-1和PtrPHO1-N1三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)示意圖Figure6 Three-dimensional structures of PtrPHT1-1， PtrPHT1-9， PtrPHT2-1 and PtrPHO1-N1 in P.trichocarpa

表4 毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PtrPHT1-1，PtrPHT1-9，PtrPHT2-1和PtrPHO1-N1的亞細(xì)胞定位結(jié)果Table4 Subcellular localizations of PtrPHT1-1， PtrPHT1-9， PtrPHT2-1 and PtrPHO1-N1 in P.trichocarpa

3 討論

本試驗(yàn)的研究對(duì)象來自于毛果楊全基因組數(shù)據(jù)庫中的磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列，獲得的31條序列中，除了13條磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列已公布外[7]，還另外發(fā)現(xiàn)了18個(gè)該家族成員。經(jīng)軟件比對(duì)得知，新發(fā)現(xiàn)的18個(gè)蛋白成員中除PtrPHT1-N1和PtrPHT1-N2外，均屬于PHO1和PHO2亞家族。同源性比較發(fā)現(xiàn)，毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞家族序列之間相似性較低，均為10%左右，而與其他模式生物同一亞家族間相似性較高，可達(dá)70%～80%。磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在各物種內(nèi)的PHT與PHO亞家族之間的相似性都比較低，而各PHT亞家族之間相似性稍高，說明PHT與PHO亞家族可能最早分開，獨(dú)立進(jìn)化。

磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PtrPHT1-1，PtrPHT1-9，PtrPHT2-1和PtrPHT1-N1均為疏水性蛋白，這也屬于跨膜蛋白的基本性質(zhì)。3種PHT蛋白均含有12個(gè)跨膜域，PtrPHO1-N1的跨膜域數(shù)為5～6個(gè)，這也印證了其疏水性低于3種PHT蛋白的預(yù)測(cè)。4種蛋白都屬于全α型蛋白質(zhì)，并且各種構(gòu)件所占比例相似。

三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的重點(diǎn)和難點(diǎn)，同時(shí)也是解釋蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的關(guān)鍵步驟。目前，通過計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的方法主要有3種：同源建模、折疊識(shí)別和從頭預(yù)測(cè)法[12]。試驗(yàn)中對(duì)PtrPHT1-1，PtrPHT1-9，PtrPHT2-1和PtrPHO1-N1三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)首先使用的是同源建模法。然而，服務(wù)器自動(dòng)在PDB蛋白晶體庫中搜索到的模型匹配度均未達(dá)到30%的要求[17]，預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性較低，故進(jìn)而采用折疊識(shí)別法對(duì)其進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。結(jié)合預(yù)測(cè)結(jié)果可分析出，PtrPHO1-N1中的α-螺旋比例并不少于PHT亞家族的3個(gè)成員，而只是其多數(shù)α-螺旋較短，從而使其具有更多數(shù)量的α-螺旋片段。這也導(dǎo)致PtrPHO1-N1中的部分α-螺旋沒有足夠強(qiáng)的疏水性，因而無法跨膜，便印證了它只有5～6個(gè)跨膜域的分析結(jié)果。本研究的亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，PtrPHT1-1，PtrPHT1-9和PtrPHO1-N1位于質(zhì)膜上，參與磷酸根的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)。而PtrPHT2-1可能定位于質(zhì)膜、液泡膜或者高爾基體膜。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及本研究中對(duì)其他磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞家族的定位與功能分析，PtrPHT2-1定位于液泡膜的可能性最大。若定位于液泡膜，可能說明植物通過磷素跨液泡膜的雙向運(yùn)輸實(shí)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)中磷濃度的穩(wěn)態(tài)[15]。

4 結(jié)論

在毛果楊全基因組數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)的31個(gè)毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可分為4個(gè)亞家族，即PHT1，PHT2，PHO1和PHO2。磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白定位于生物膜上起轉(zhuǎn)運(yùn)磷酸根的作用。保守基序預(yù)測(cè)得知，毛果楊PHT亞家族內(nèi)的保守性高，而亞家族之間的差異較大；PHO的保守性較PHT小。系統(tǒng)發(fā)育分析得知，毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白各亞家族可能分開較早，尤其是PHT1，PHT2亞家族與PHO1，PHO2亞家族兩者之間差異顯著，共同基序更少。毛果楊磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均為疏水性的全α型蛋白質(zhì)，家族內(nèi)三維結(jié)構(gòu)相似，其中PHT一般具有12個(gè)跨膜域，多于PHO。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)得知，毛果楊不同亞家族成員的亞細(xì)胞定位不盡相同，這說明磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族各成員在楊樹磷素代謝中起著不同的作用，共同維持并調(diào)控楊樹體內(nèi)的磷素平衡。

[1]OKUMURA S， MITSUKAWA N， SHIRANO Y， et al.Phosphate transporter gene family of Arabidopsis thaliana[J].DNA Res， 1998， 5： 261-269.

[2]高佳，劉雄倫，劉玲，等.水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pht1家族研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（15）：31-34.GAO Jia， LIU Xionglun， LIU Ling， et al.Advance of rice phosphate transporter Pht1 [J].Chin Agric Sci Bull， 2009， 25（15）： 31-34.

[3]DARAM P， BRUNNER S， RAUSCH C， et al.Pht2；1 encodes a low-affinity phosphate transporter from Arabidopsis[J].Plant Cell， 1999， 11： 2153-2166.

[4]VERSAW W K， HARRISON M J.A chloroplast phosphate transporter PHT2 （1）influences allocation of phosphate within the plant and phosphate-starvation responses [J].Plant Cell， 2002， 14： 1751-1766.

[5]TICCONI C A， ABEL S.Short on phosphate： plant surveillance and countermeasures [J].Trends Plant Sci， 2004， 9（11）： 548-555.

[6]TUSKAN G A， DIFAZIO S， JANSSON S， et al.The genome of black cottonwood， Populus trichocarpa （Torr.and Gray）[J].Science， 2006， 313： 1596-1604.

[7]MARTIN F.The Poplar Phosphate Transporter Multigene Family： Characterization and Gene Expression [R].Southampton： The Third Popyomics Meeting， 2004.

[8]TAMURA K， DUDLEY J， NEI M， et al.MEGA4： Molecular evolutionary genetics analysis（MEGA） software version 4.0 [J].Mol Biol Evol， 2007， 24： 1596-1599.

[9]BAILEY T L， BODEN M， BUSKE F A， et al.MEME SUITE： Tools for motif discovery and searching [J].Nucleic Acids Res， 2009， 37： 202-208.

[10]GASTEIGER E， HOOGLAND C， GATTIKER A， et al.Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server[M].Springer： The Proteomics Protocols Handbook， 2005： 571-607.

[11]CLAROS M G， von HEIJNE G.TOPPRED II： An improved software for membrane protein structure predictions [J].Comput Appl Biosci， 1994， 10： 685-686.

[12]吳祖建，高芳鑾，沈建國(guó).生物信息學(xué)分析實(shí)踐[M].北京：科學(xué)出版社，2010：134-137.

[13]HORTON P， PARK K J， OBAYASHI T， et al.WoLF PSORT： protein localization predictor[J].Nucleic Acids Res，2007， 35： 585-587.

[14]KARANDASHOV V， BUCHER M.Symbiotic phosphate transport in arbuscular mycorrhizas [J].Trends Plant Sci，2005， 10 （1）： 22-29.

[15]RAGHOTHAMA K G.Phosphate transport and signaling [J].Curr Opin Plant Biol， 2000， 3 （3）： 182-187.

[16]王鏡巖，朱圣庚，徐長(zhǎng)法.生物化學(xué)：下[M].3版.北京：高等教育出版社，2002：229-231.

[17]BORDOLI L， KIEFER F， ARNOLD K， et al.Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace[J].Nat Protoc， 2009， 4： 1-13.