液基夾層杯技術用于基層實驗室結(jié)核病診斷的可行性研究

宋紅煥 季明 唐國鋒 朱瑋 朱澄玉 陳誠 許衛(wèi)國 陸偉

液基夾層杯技術用于基層實驗室結(jié)核病診斷的可行性研究

宋紅煥 季明 唐國鋒 朱瑋 朱澄玉 陳誠 許衛(wèi)國 陸偉

目的評價液基夾層杯法在基層實驗室用于結(jié)核病診斷的可行性及安全性>。方法在泰興、江陰CDC兩個縣級結(jié)核病實驗室，對385例疑似肺結(jié)核患者的754份痰標本同時采用液基夾層杯法與直接痰涂片法進行鏡檢，結(jié)合臨床診斷，比較2種方法的陽性檢出率。采用四格表Fisher確切概率法進行比較，并進一步比較兩種方法對不同性狀、不同時間收集的痰標本的陽性率。選取12份陽性痰標本，設定不同的痰消化液比例，不同的消化時間，加熱與否處理痰標本，將處理后的消化液接種到羅氏培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，通過比較生長情況評價液基法的安全性>。結(jié)果液基夾層杯法、直接痰涂片法對754份痰標本的陽性檢出率分別為23.5%（177／754）、16.8%（127／754），檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝48.02，P＝0.000）；比較不同性狀、不同時間采集的痰標本采用兩種方法的檢測結(jié)果，得出膿痰直涂法陽性檢出率為40.9%（81／198），液基法陽性檢出率為47.5%（94／198），兩種方法對于膿痰的檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義（Fisher確切概率法，P確切概率＜0.001）；非膿性痰（包括血痰、黏液痰、口水痰）直涂法陽性檢出率為4.7%（9／193），液基法陽性檢出率為13.5%（26／193），差異有統(tǒng)計學意義（P確切概率值均＜0.001）。安全性試驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)消化液處理的痰標本，培養(yǎng)8周后未見結(jié)核分枝桿菌生長>。結(jié)論液基夾層杯法提高了疑似肺結(jié)核患者細菌學檢查的陽性檢出率，且操作簡單、安全性高，適合在基層實驗室應用并便于開展質(zhì)量控制，是一種很有推廣價值的檢測方法。

結(jié)核，肺／診斷； 分枝桿菌，結(jié)核； 痰； 細菌學技術； 可行性研究

結(jié)核病是一種長期危害人類健康的重大傳染病之一，我國是全球僅次于印度的第二大結(jié)核病高負擔國家，對結(jié)核病做出快速、準確的診斷一直是結(jié)核病控制工作中的難點。目前，我國結(jié)核病防治規(guī)劃結(jié)核病實驗室主要檢查方法是直接痰涂片鏡檢（簡稱“直涂法”），該方法操作簡便，成本低廉，但靈敏度低；而傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)法周期較長（4～8周），目前最快的液體培養(yǎng)也需要10d左右，并且在痰標本前處理及后期培養(yǎng)過程中可能導致Mtb死亡，易產(chǎn)生假陰性結(jié)果。此外，部分實驗室也采用傳統(tǒng)的集菌法進行檢測，但也存在操作過程繁瑣、安全性不高等問題。如何研發(fā)、推廣應用結(jié)核病病原體快速檢測新技術是目前世界衛(wèi)生組織、國內(nèi)外結(jié)核病控制機構和組織所共同致力的研究工作。本研究探討了國家科技重大專項研究的結(jié)核病診斷新技術——液基夾層杯法抗酸桿菌檢驗技術（簡稱“液基法”）在基層實驗室應用的可行性，參照國際結(jié)核病診斷新技術的評價方法，進行了驗證評價。

資料和方法

一、一般資料

1.資料來源：按照項目要求，收集艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治科技重大專項（2009ZX10004-904）示范區(qū)江蘇省泰州市泰興市CDC結(jié)核病門診及無錫市江陰市CDC結(jié)核病門診2010年1月至8月初診疑似肺結(jié)核病患者385例，其中男性261例，女性124例，平均年齡（49.12±18.77）歲，年齡最小的20歲，年齡最大的90歲。每位患者按要求分別采集即時痰、夜間痰、次日晨痰3份痰標本，將符合要求的754份痰標本（標本量＞2ml）同時采用直涂法及液基法檢測Mtb。選取泰興項目點分析不同性狀痰標本兩種方法檢測的陽性率，泰興項目點共收集痰標本391份，其中口水痰29份、血痰12份、黏液痰152份、膿痰198份。所有入選患者的診斷均符合《中國結(jié)核病防治規(guī)劃實施工作指南（2008版）》［1］規(guī)定的疑似肺結(jié)核診斷標準。實驗分別在兩個項目點實驗室同時進行。

385例患者共收集痰標本1155份，其中401份標本因標本量太少（＜2ml）無法滿足此研究方法的要求，最終有754份標本納入本研究，其中即時痰332份，夜間痰288份，次日晨痰134份；泰興391份，江陰363份；選取泰興項目點收集的痰標本分析兩種方法用于不同性狀痰標本檢測陽性率的比較，膿痰198份，非膿性痰（血痰、黏液痰、口水痰）193份。

2.試劑和儀器：液基法所用試劑及儀器均由湖南天騎醫(yī)學新技術有限公司提供：TQ212型自動離心涂片機、彭氏杯為湘藥管械（準）字2005第2410002；其專利號分別為200420036036.7、200520049875.7。消化液注冊號：湘（懷）食藥監(jiān)械（準）字2005第1410005號。KP21型快速干片機、抗酸桿菌自動閱片計算機報告系統(tǒng)及抗酸染液試劑盒。羅氏培養(yǎng)基由江蘇省CDC結(jié)核病參比實驗室制備。

二、方法

（一）項目實施情況

項目實施分為預實驗階段和驗證階段。預實驗階段為期1個月，實驗人員按照項目要求，同時采用直涂法和液基法對標本進行處理，目的在于使實驗室人員熟悉項目的各項要求，并熟練掌握液基法的操作流程，為后期項目順利開展提供良好的基礎。預實驗階段，泰興、江陰兩個項目點的全部直涂法涂片和液基法涂片由泰州市CDC結(jié)核病實驗室進行復核。預實驗結(jié)束，由江蘇省CDC結(jié)核病參比實驗室對2個項目點進行考核，復核及考核結(jié)果合格后進入驗證階段，預實驗數(shù)據(jù)不納入統(tǒng)計范圍，在驗證階段，采用的質(zhì)量控制方式為泰州市CDC對2個點每個月隨機抽取30%的痰涂片進行復核，及時發(fā)現(xiàn)并解決項目運行中產(chǎn)生的問題。具體方式為：每個月末統(tǒng)計兩個項目點的實驗室登記本該月的痰涂片總數(shù)，按照比例計算總抽片數(shù)，計算間隔＝痰涂片總數(shù)／總抽片數(shù)，按照此間隔隨機進行抽片。痰涂片質(zhì)量控制參照《中國結(jié)核病防治規(guī)劃——痰涂片鏡檢標準化操作及質(zhì)量保證手冊》［2］進行。

（二）實驗方法

1.直涂法：按《中國結(jié)核病防治規(guī)劃——痰涂片鏡檢標準化操作及質(zhì)量保證手冊》［2］進行涂片、染色、鏡檢和記錄結(jié)果。

2.液基法：具體操作按照說明書進行。

3.液基法安全性試驗：液基法檢測樣本時首先采用標本消化液對痰標本進行處理，消化液的主要成分為含氯消毒劑，其作用主要為消化痰液，釋放分枝桿菌；本方法檢測時，除消化外的其他步驟均在生物安全柜外進行，故消化液的性能直接影響方法的安全性。本次實驗選取直涂法結(jié)果4＋的痰標本12份，每份標本約2ml進行液基法安全性試驗，設定不同的痰消化液比例（1∶1，1∶2），不同的消化時間（5、10、15min），加熱與否處理痰標本，將處理后的消化液接種到羅氏培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，觀察其生長情況。

（三）統(tǒng)計學方法

Microsoft excel錄入數(shù)據(jù)，配對資料采用配對χ2檢驗和確切概率法進行檢驗，SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、實驗室檢測結(jié)果

385例患者中直涂法檢出涂陽患者64例，液基法檢出88例；在754份痰標本中液基法檢出陽性片177張，陽性率23.5%，直涂法檢出陽性涂片127張，陽性率為16.8%。比較兩種方法的陽性檢出率，差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝48.02，P＝0.000），對直涂法陰性，液基法陽性的24例患者做進一步分析發(fā)現(xiàn)，臨床診斷均為涂陰肺結(jié)核患者。

二、不同性狀痰標本陽性檢出率比較

選取泰興項目點收集的痰標本分析兩種方法用于不同性狀痰標本檢測陽性率的比較，得出膿痰直涂法陽性檢出率為40.9%（81／198），液基法陽性檢出率為47.5%（94／198），兩種方法對于膿痰的檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義（Fisher確切概率法，P確切概率＜0.001）；非膿性痰（包括血痰、黏液痰、口水痰）直涂法陽性檢出率為4.7%（9／193），液基法陽性檢出率為13.5%（26／193），兩種方法對于非膿性痰的檢測結(jié)果差異亦有統(tǒng)計學意義（Fisher確切概率法，P確切概率＜0.001）。

三、不同時間收集痰標本陽性檢出率比較

其中即時痰采用直涂法與液基法兩種方法陽性檢出率分別為15.1%（50／332）、20.5%（68／332）；夜間痰為17.0%（49／288）、25.7%（74／288）；次日晨痰為20.9%（28／134），26.1%（35／134），檢測結(jié)果差異均有統(tǒng)計學意義（P確切概率值分別為＜0.001、＜0.001、＜0.05）。

四、液基法安全性試驗結(jié)果

當加入1～2倍于標本的標本消化液，混勻后，不管加熱與否，放置5～15min，接種于羅氏培養(yǎng)基上。37℃，培養(yǎng)8周后均未見Mtb生長（表1）。

討 論

液基法為一種新型的集菌技術，與直涂法相比本質(zhì)上是一樣的。目前我國大多數(shù)縣級基層結(jié)核病實驗室仍采用直接涂片－抗酸染色技術作為結(jié)核病實驗室診斷的主要技術，該技術操作過程簡單、快速、成本低，但是靈敏度不高，有研究表明痰涂片檢測診斷肺結(jié)核的靈敏度為20%～80%［3－5］，容易造成漏診。液基夾層杯技術是對該方法進行改良和創(chuàng)新的基礎上形成的，不僅保留了直涂法快速、直觀、費用低的特點，而且還具有陽性檢出率高、安全性高、標準化程度高等直涂法所不具備的優(yōu)勢。

表1 液基法安全性試驗結(jié)果

液基法技術的創(chuàng)新主要體現(xiàn)在離心集菌、消化液處理痰標本方面，其作用主要有以下2個方面：一是徹底消化痰液、細胞，完全釋放 Mtb；二是滅活Mtb，保障后期操作的生物安全，然后通過加熱、高速離心，將釋放出來已滅活的Mtb集聚到彭氏夾層杯底部的基片上，再進行染色鏡檢，其操作與直涂法基本一致?；诖藙?chuàng)新點，該技術有陽性率高及安全性高的優(yōu)勢，本研究亦證實了這一點。

本研究中液基法對754份痰標本的陽性檢出率為23.5%，直涂法為16.8%；比較兩個方法的陽性檢出率，差異有統(tǒng)計學 意義 （χ2＝48.02，P＜0.001）。分析不同性狀痰標本兩種方法檢測結(jié)果的陽性率，得出膿性痰直涂法陽性檢出率為40.9%，液基法陽性檢出率為47.5%，非膿性痰直涂法陽性檢出率為4.7%，液基法陽性檢出率為13.5%；由數(shù)據(jù)可以看出，非膿性痰采用液基法，相對陽性檢出率提高水平比膿性痰更為明顯。筆者分析不同時間采集的痰標本采用兩種方法的陽性檢出率，其中即時痰采用兩種方法陽性檢出率分別為15.1%、20.5%；夜間痰分別為17.01%、25.60%；次日晨痰為分別20.9%、26.1%，差異均有統(tǒng)計學意義。對直涂法陰性、液基法陽性的24例疑似患者作進一步分析發(fā)現(xiàn)：臨床最終診斷均為涂陰患者；另外有研究表明以培養(yǎng)法作為金標準，液基法診斷的靈敏度高于直涂法［6］，表明液基法在一定程度上提高了傳染性結(jié)核病患者的發(fā)現(xiàn)率，對于結(jié)核病的防治工作有著重要的意義。

綜上所述，液基法推薦的痰標本消化操作流程可以滿足生物安全的要求。同時液基法可以批量處理標本，可以確保多個標本處理的一致性。此外標本收集、保存、用量可完全量化控制；標本消化、離心涂片、染色可量化操作；染色加溫時的溫度和時間可準確設定，整個過程便于標準化，保證了痰涂片的制備質(zhì)量［7］。說明液基夾層杯法在基層實驗室用于結(jié)核病診斷有一定的推廣價值。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部疾病預防控制局，中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司，中國疾病預防控制中心.中國結(jié)核病防治規(guī)劃實施工作指南（2008年版）.北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社，2009：20-27.

［2］趙雁林，姜廣路.中國結(jié)核病防治規(guī)劃——痰涂片鏡檢標準化操作及質(zhì)量保證手冊.北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社，2009：7-14.

［3］Behr MA，Warren SA，Salamon H，et al.Transmission ofMycobacterium tuberculosisfrom patients smear-negative for acid-fast bacilli.Lancet，1999，353（9151）：444-449.

［4］Grzybowski S，Barnett GD，Styblo K.Contacts of cases of active pulmonary tuberculosis.Bull Int UnionTuberc，1975，50（1）：90-106.

［5］Urbanczik R.Present position of microscopy and of culture in diagnostic mycobacteriology.Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg A，1985，260（1）：81-87.

［6］楊華林，譚云洪，白麗瓊，等.液基夾層杯技術檢測抗酸桿菌應用性研究.中國防癆雜志，2011，32（5）：279-282.

［7］王改，曹青山，王金繩，等.夾層杯集菌離心涂片法檢測痰抗酸桿菌對肺結(jié)核診斷價值的研究.中國民康醫(yī)學，2007，19（8）：614.

Feasibility study of the Liquid-based Peng’s interlayer vessel technique on diagnosis of tuberculosis in primary level labo-ratory

SONG Hong-huan＊，JI Ming，TANG Guo-feng，ZHU Wei，ZHU Cheng－yu，CHEN Cheng，XU Wei-guo，LU Wei.＊Chronic Infection Prevention，Jiangsu Center for Disease Control and Prevention，Nanjing210009，China Correspondingauthor：LU Wei，Email；jsjkmck＠163.com

ObjectiveTo evaluate the feasibility and security of Liquid-based Peng’s interlayer vessel technique used for diagnosis of tuberculosis in primary level laboratory.MethodsIn two primary level laboratories of Taixing and Jiangyin Center for Disease Control and Prevention，754sputum samples from 385suspect TB patients were tested simultaneously by two methods：sputum smear and acid-fast staining microscopy examination （direct AFB）and Liquid-based Peng’s interlayer vessel technique.According to clinical diagnosis，the positive rates of the two methods for the sputum samples with different traits or collected at different times were compared by Fisher probabilities in 2×2table.12bacterium-positive sputa were treated with different proportion of digestion liquid，different digestion time，and heating or not.Then the digestive sputa were inoculated at Roche medium at 37℃.The security of the liquid-based method was evaluated by preparing the growth of mycobacteria. Results The positive rates of Liquid-based Peng’s interlayer vessel technique and the direct AFB were 23.5% （177／754）and 16.8%（127／754）respectively，which had significant difference（χ2＝48.02，P＝0.000）.The positive rates of these two methods in purulent sputa were 47.5% （94／198）and 40.9% （81／198），which had significant differences（P＜0.001）.The positive rates for the non-purulent sputa（including bloody sputa，mucus sputa and saliva sputa）were 13.5% （26／193）and 4.7% （9／193）（P＜0.001）.The sputum samples treated with the digestive liquid were not found the growth of Mycobacteria after the culture for 8weeks. Conclusion Liquid-based Peng’s interlayer vessel technique can improve the positive detection rate in suspect TB patients.It is simple，safe，and suitable for the application at primary laboratory for the diagnosis of tuberculosis and convenient for quality control.

Tuberculosis，pulmonary／diagnosis； Mycobacterium，tuberculosis； Sputum； Bacteriological techniques； Feasibility studies

“十一五”國家科技重大專項（2009ZX10004-904）

210009，南京，江蘇省疾病預防控制中心慢性傳染病防制所 （宋紅煥、陳誠、許衛(wèi)國、陸偉）；泰興市疾病預防控制中心結(jié)核病防制科（季明、朱瑋）；江陰市疾病預防控制中心結(jié)核病防制科（唐國鋒、朱澄玉）

陸偉，Email：jsjkmck＠163.com

2012-01-10）

（本文編輯：張曉進）