梓樹屬植物基因組DNA提取及RAPD體系優(yōu)化

王 念，王巧玲

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梓樹屬植物基因組DNA提取及RAPD體系優(yōu)化

王 念1，王巧玲2

（1.河南省林木良種選育與種質資源保護重點實驗室，鄭州 450008； 2.河南省林業(yè)調查規(guī)劃院，鄭州 450045）

以楸樹幼嫩葉片為材料，進行楸樹基因組DNA提取及RAPD擴增條件優(yōu)化，試驗表明，采用改良的2×CTAB法提取的DNA質量較高，適宜于RAPD分析。RAPD反應的優(yōu)化體系為（25 ul反應體系）：17.8 ul ddH2O；0.5 ul dNTP；2.5 ul 10×buffer；1.0 ul 隨機引物；2.0 ul Mgcl2；1.0 ul模版；0.2 ul Taq 酶 。

楸樹；DNA提??；RAPD

梓樹屬是紫葳科的關鍵物種。在梓樹屬中楸樹最為名貴，是我國傳統(tǒng)的優(yōu)質珍貴用材樹種，素有“木王”之稱[1]。隨機擴增多態(tài)DNA(Random Amplified Polymorphic DNA,簡稱RAPD)是J.Wi11iams和J.Welsh[2]研究小組于1990年同時提出的一種隨機引物擴增、尋找多態(tài)DNA片段的遺傳標記技術。RAPD以PCR技術為基礎，以基因組DNA為模板，以單個人工合成的隨機多態(tài)核苷酸序列（通常為10個堿基對）為引物，在熱穩(wěn)定的DNA聚合酶作用下，進行PCR擴增[3]。擴增產(chǎn)物的多態(tài)性反映了基因組片段的多態(tài)性。RAPD技術在物種親緣關系、系統(tǒng)發(fā)育分子水平的鑒別，以及分子生物學、分子生態(tài)學的研究中能夠起到重要的作用。我們對梓樹屬植物基因組DNA提取及RAPD擴增條件優(yōu)化進行了初步研究，為梓樹屬植物分子水平的深入研究奠定了良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料金絲楸（J）、灰楸（H）、梓樹（Z）、美國梓樹（M）、豫楸1號（Y）來自河南省林業(yè)科學研究院試驗場。隨機引物由大連寶生物生物工程公司合成，Taq酶，dNTP，10×PCR Buffer，Mg2+均購自上海生物工程公司。PCR擴增采用美國伯樂公司MyCycler PCR擴增儀器，凝膠成像采用伯樂Gel Doc XRTM凝膠成像分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1梓樹屬基因組DNA提取

采用2×CTAB法提取梓樹屬基因組DNA：①取幼嫩葉片加液氮研磨成粉末狀，轉入1.5 ml離心管中；②加入600 ul 65℃預熱的2×CTAB溶液混勻并置于65℃水浴中保溫30～60 min；③取出冷卻后，上下?lián)u勻，加入600 ul的氯仿異戊醇（24∶1），12 000 r/min離心10 min，④取上清液于另1個1.5 ml的離心管中；加600 ul異丙醇，12 000 r/min離心10 min，倒掉上清液，用75%的酒精清洗，沉淀晾干后加100 ul無菌水溶解；⑤加10 ul（10 mg/ml）的RNA酶，37℃水浴酶解1 h，補水至500 ul；⑥加500 ul的苯酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1），混合均勻，12 000 r離心10 min，抽提純化2次；⑦取上清液，加入等體積的氯仿，混合均勻，12 000 r離心10 min；⑧取上清液，加入1/10體積3 mol/L的乙酸鈉和2.5倍體積的預冷無水乙醇，-20℃放置30 min以上；⑨12 000 r離心10 min后，沉淀即為提取得到的基因組DNA，用70％酒精清洗3次，晾干后加100 ul TE或無菌水溶解。

1.2.2基因組DNA濃度及質量檢測

將原液稀釋50倍后，用紫外分光光度計測定DNA樣品在260 nm和280 nm的吸光度，計算OD260 nm/OD 280 nm的值，按1 OD260=50 ng/μl計算基因組DNA原液的濃度，即50×OD260 ×稀釋倍數(shù)。

瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA片段的大小，將DNA樣品用無菌水稀釋50倍，取5 ul用0.8瓊脂糖進行凝膠電泳分析，檢測所提取DNA片段量。

RAPD分子標記技術的缺點就是重復性差，試驗過程中容易受到反應體系中其他因素的影響，比如退火溫度、模板DNA質量、擴增參數(shù)的設置等。該研究對影響擴增的主要因素Mg2+的濃度、Taq聚合酶的用量、dNTP的用量進行了優(yōu)化，建立適宜梓樹屬反應的優(yōu)化體系。

采用25 ul反應體系，包括ddH2O、dNTP、10×Buffer、引物、模板、Taq酶，設置鎂離子濃度梯度為50 umol/L、100 umol/L、150 umol/L、200 umol/L、250 umol/L；dNTP濃度梯度為50 umol/L 、100 umol/L 、150 umol/L 、200 umol/L、250 umol/L；Taq酶濃度梯度0.5 U、1.0 U、1.5 U、2.0 U、2.5 U，通過對比試驗找出最佳反應體系，并利用42種不同引物進行優(yōu)化條件的檢驗。

1.3 DNA擴增反應程序

根據(jù)樹種的不同和引物合成的退火溫度，程序設置如下：首先進行預變性95℃ 5 min，預變性之后進入循環(huán)體系：變性：94℃ 30 s；退火：36℃ 30 s；延伸：72℃ 45 s，共45個循環(huán)，最后72℃再延伸10 min，反應結束后4℃保存。

1.4 電泳檢測

實驗結束后，取15 ul擴增產(chǎn)物用0.5倍TBE電泳緩沖液，在1.5%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，電壓為100 V。電泳結束，EB染色20 min后，在伯樂凝膠成像儀下觀察、拍照。

2 結果分析

2.1 梓樹屬基因組DNA提取質量及電泳分析

通過分光光度計分析得知提取得到的DNA濃度較高，樣品色澤白色透明，OD260nm/ OD280nm為1.73，接近1.8，表明DNA濃度符合RAPD分析要求。

通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離檢測，溴化乙錠染色，觀察DNA分子的完整性，結果見圖1?；蚪MDNA在凝膠上表現(xiàn)為一條規(guī)則的帶，基本無降解現(xiàn)象，有少量的RNA，但不影響RAPD分析。

圖1 楸樹基因組總DNA電泳圖譜

2.2 RAPD擴增條件優(yōu)化結果及參數(shù)確定

2.2.1鎂離子和dNTP濃度優(yōu)化及結果

該實驗設計了鎂離子為50 um/L、100 um/L、150 um/L、200 um/L、250 um/L的濃度梯度，從實驗結果分析，鎂離子濃度對擴增產(chǎn)物的影響很明顯：濃度太低時，沒有擴增產(chǎn)物出現(xiàn)（圖2中第1、2泳道），濃度太高時，條帶模糊且多態(tài)性低（圖2中的5泳道）。在濃度為150 um/L或200 um/L時條帶多且較為清晰。

在擴增反應體系中，dNTP是PCR反應的原料，在實驗過程中會螯合部分鎂離子，減少溶液中鎂離子的數(shù)量，導致擴增譜帶的改變直至產(chǎn)物消失。因此，鎂離子和dNTP的濃度要綜合考慮，結合實驗結果（見圖2），采用鎂離子最終濃度是200 umol/L，dNTP的最佳濃度是50 umol/L。

圖 2 dNTP和鎂離子濃度優(yōu)化擴增效果

2.2.2 Taq酶濃度優(yōu)化及結果

該實驗設計Taq酶5個濃度梯度，分別是25 ul體系中0.5 U、1 U、1.5 U、2 U、2.5 U。由圖3的電泳圖可見，Taq酶以1 U為最好，條帶多而且清晰，濃度減少條帶清晰度下降，而濃度增加條帶變粗，背景較模糊。

圖3 Taq酶濃度優(yōu)化擴增效果

2.3 RAPD擴增條件優(yōu)化參數(shù)確定

經(jīng)過對鎂離子、dNTP、Taq酶的優(yōu)化，建立如下RAPD優(yōu)化體系：10×buffer：2.5 ul；Mgcl2：2.0 ul；dNTP：0.5 ul；Taq酶：0.2 ul；引物：1.0 ul；模板：1.0 ul，加雙蒸水至25 ul。

PCR循環(huán)參數(shù)設定：95℃預變性5 min，94℃變性30 s、36℃退火30 s、72℃延伸45 s，進行45個循環(huán)，然后72℃延伸10 min，最后4℃保存。

2.4 梓樹屬基因組RAPD測定結果

用優(yōu)化參數(shù)和選定的擴增條件對梓樹屬5種植物基因組DNA進行擴增，擴增產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖電泳分離，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)照相，結果見圖4。由圖4可見，DNA擴增圖譜清晰，豫楸1號和金絲楸譜帶相同，這和豫楸1號是從金絲楸中選育出來的實踐結果一致。不同品種之間DNA存在明顯的多態(tài)性，其中1 500 bp為5個品種所共有，在不同樣本中沒有變異，這表明它們是比較保守的DNA片斷，其他條帶在不同品種和個體中或有或無，這反映了梓樹屬品種的遺傳多樣性，同時也說明了我們建立的RAPD優(yōu)化體系適合梓樹屬植物遺傳多樣性分析。

圖4 不同品種在不同引物條件下的RAPD擴增效果

3 結論與討論

通過對反應體系的優(yōu)化，建立了梓樹屬植物的RAPD-PCR最佳反應體系，為下一步進行梓樹屬植物種質資源的RAPD分析及其親緣關系鑒定、遺傳多樣性研究提供了可靠的試驗依據(jù)。

在優(yōu)化RAPD擴增條件過程中，應盡可能找出各種對RAPD 擴增產(chǎn)生不良影響的高低變數(shù)[4]。多次實驗證明，采用梯度設置法是優(yōu)化RAPD擴增條件的簡便快速、經(jīng)濟實用方法，它使RAPD擴增條件優(yōu)化過程實現(xiàn)了程序化和數(shù)量化，采用該方法、程序與策略，可以在短時間內獲得RAPD擴增全部優(yōu)化參數(shù)，節(jié)約大量的試劑、DNA樣本和實驗時間，應用該方法進行RAPD 擴增可以獲得圖譜清晰、穩(wěn)定可靠的實驗效果。

[1]郭從儉. 楸樹栽培[M]. 北京：中國林業(yè)出版社，1988．

[2] Willamas J.G. Kubelik.A.R. Livak,K.J.etc. DNA Polymorphisms as amplified by arbitrary primers are useful as genetic marker[J]. Nucleic AciRes.1990, 1(18): 6531-6535.

[3]黃映萍. DNA分子標記研究進展[J]. 中山大學研究生學刊，2010，31（2）：27-36.

[4]奧斯伯F，金斯頓RE，塞德曼JG，等. 精編分子生物學實驗指南[M]. 北京：北京科學出版社，1999：37-39.

Genomic DNA Extraction and Optimization of RAPD System of Catalpa Scop

WANG Nian1, WANG Qiao-ling2

（1.Key Laboratory of Forest Germplasm Conservation、Breeding of Improved Variety of Henan-Province,Zhengzhou 450008, China; 2. Henan Forest Inventory and Planning Institute, Zhengzhou 450045, China)

The method of genomic DNA extraction from new leaves and the optimization of RAPD analytic conditions were studies in Catalpa bungei. The result showed that the high-quality genomic DNA was obtained by the revised 2×CTAB method. The optimal PCR system for RAPD analysis was as follows:17.6ul ddH2O;0.5ul dNTP;2.5ul 10×buffer; 1.0ul random Primer;2.0ul Mgcl2;1.0ul template;0.4ul Taq polymerase in 25ul reaction system.

Catalpa bungei; Genomic DNA extraction; RAPD

Q 343.1

A

1003-2630（2012）01-0001-03

2012-02-15

國家林業(yè)局“十二五”科技支撐項目（編號：2012BAD01B05）。

王念（1978-），女，河南省上蔡縣人，工程師，主要從事林木遺傳育種研究。

（責任編輯：王文彬）