紅色熒光蛋白和熒光素酶雙報(bào)告基因轉(zhuǎn)基因小鼠的建立

張余琴 林曉琳 賈俊雙 謝饒英 樊全榮 趙尊蘭楊升 高飛 姚開泰 肖東

南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所，△比較醫(yī)學(xué)研究所暨實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東 廣州 510515

紅色熒光蛋白和熒光素酶雙報(bào)告基因轉(zhuǎn)基因小鼠的建立

張余琴 林曉琳 賈俊雙 謝饒英 樊全榮 趙尊蘭楊升 高飛 姚開泰 肖東△

南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所，△比較醫(yī)學(xué)研究所暨實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東 廣州 510515

背景與目的：活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像(opticalin vivoimaging)主要采用生物發(fā)光與熒光兩種技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶(luciferase，Luc)基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，而熒光技術(shù)則采用熒光報(bào)告基團(tuán)(GFP、RFP、Cyt及dyes等)進(jìn)行標(biāo)記，利用一套非常靈敏的光學(xué)檢測儀器，能夠直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)和基因行為，生物發(fā)光成像具有高的靈敏度和特異性，同時(shí)生物發(fā)光信號(hào)可用于精確定量，而熒光成像具有方便、便宜、直觀、標(biāo)記靶點(diǎn)多樣和易于被大多數(shù)研究人員接受的優(yōu)點(diǎn)。本研究基于慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法制備紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)和Luc雙報(bào)告基因轉(zhuǎn)基因小鼠(即RL轉(zhuǎn)基因小鼠)，將這兩種技術(shù)融為一體。方法：制備攜帶RFP和Luc基因(簡寫RL基因)的慢病毒，然后將攜帶RL基因的慢病毒注入小鼠單細(xì)胞受精卵卵周隙以感染受精卵，胚胎移植進(jìn)假孕母鼠以獲得仔鼠，應(yīng)用小動(dòng)物活體成像儀、體視熒光顯微鏡和PCR等在蛋白和DNA水平上篩選和鑒定，并獲得RL轉(zhuǎn)基因小鼠。結(jié)果：移植卵周隙注射有慢病毒的胚胎125枚給6只假孕母鼠，其中4只假孕母鼠懷孕，共生仔鼠20只；利用小動(dòng)物活體成像儀檢測RFP和Luc表達(dá)，在蛋白水平證實(shí)20只F0代中，3只高表達(dá)RFP和Luc；DNA水平檢測證實(shí)，3只RFP和Luc陽性的小鼠基因組中確實(shí)整合有外源轉(zhuǎn)基因RL，預(yù)示基因型鑒定結(jié)果很好驗(yàn)證了小動(dòng)物活體成像儀篩選和鑒定結(jié)果。此外，RL轉(zhuǎn)基因首建鼠基因組中整合的RL轉(zhuǎn)基因可穩(wěn)定遺傳至下一代，并能正常表達(dá)。RL轉(zhuǎn)基因小鼠主要臟器均可見紅色熒光和Luc信號(hào)，但不同臟器間熒光和Luc強(qiáng)度有差異。結(jié)論：成功制備RL雙報(bào)告基因轉(zhuǎn)基因小鼠，為后續(xù)研究干細(xì)胞在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用和造血重構(gòu)等提供雙報(bào)告基因標(biāo)記的各種移植用供體細(xì)胞，并對(duì)此供體細(xì)胞及其在體內(nèi)衍生的細(xì)胞進(jìn)行靈敏的非損傷、實(shí)時(shí)可視化體內(nèi)跟蹤。

紅色熒光蛋白；熒光素酶；慢病毒載體法；腫瘤干細(xì)胞；轉(zhuǎn)基因小鼠

活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像(opticalin vivoimaging)主要采用生物發(fā)光(bioluminescence)與熒光(fluorescence)兩種技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶(luciferase，Luc)基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，而熒光技術(shù)則采用熒光報(bào)告基因(GFP、RFP)，或Cyt及dyes等熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，利用報(bào)告基因產(chǎn)生的生物發(fā)光，熒光蛋白質(zhì)或染料就可以形成體內(nèi)的生物光源。兩者的主要區(qū)別在于前者是動(dòng)物體內(nèi)的自發(fā)熒光，不需要激發(fā)光源，而后者則需要外界激發(fā)光源的激發(fā)。生物發(fā)光成像和熒光成像有各自的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，比如生物發(fā)光成像具有高的靈敏性和特異性，同時(shí)生物發(fā)光信號(hào)可用于精確定量；而熒光成像具有方便、便宜、直觀、標(biāo)記靶點(diǎn)多樣和易于被大多數(shù)研究人員接受的優(yōu)點(diǎn)。為將生物發(fā)光成像和熒光成像的優(yōu)點(diǎn)集為一體，Cao等［1］將綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠和Luc轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行交配以獲得雙報(bào)告基因(GFP和Luc)的轉(zhuǎn)基因小鼠，然后再從該雙報(bào)告基因轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓中分離得到雙報(bào)告基因標(biāo)記的移植供體細(xì)胞——造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSCs)，以供移植實(shí)驗(yàn)來研究造血重構(gòu)，從而在小鼠上實(shí)現(xiàn)了非損傷、實(shí)時(shí)和可視體內(nèi)跟蹤移植供體細(xì)胞及其在體內(nèi)衍生的細(xì)胞，結(jié)果多報(bào)告基因(GFP或RFP和Luc)標(biāo)記的移植細(xì)胞較單報(bào)告基因(GFP、RFP或Luc)標(biāo)記的移植細(xì)胞在實(shí)際應(yīng)用中更具有優(yōu)勢。目前，報(bào)告基因(GFP、RFP或Luc)表達(dá)受無細(xì)胞或無組織特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因小鼠，絕大多數(shù)是單報(bào)告基因［1-3］，而通過單報(bào)告基因小鼠交配的方法獲得雙報(bào)告基因標(biāo)記的供體移植細(xì)胞需花費(fèi)較長時(shí)間。為此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法制備紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)和Luc (簡寫RL)雙報(bào)告轉(zhuǎn)基因小鼠，為相關(guān)研究提供雙報(bào)告基因標(biāo)記的各種移植用供體細(xì)胞，借助該類細(xì)胞有助于將生物發(fā)光、熒光兩項(xiàng)技術(shù)融為一體，從而為實(shí)現(xiàn)靈敏的非損傷、實(shí)時(shí)和可視化體內(nèi)跟蹤移植供體細(xì)胞及其在體內(nèi)衍生的細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 載體和細(xì)胞

慢病毒載體pRL由本課題組構(gòu)建，pRL中含紅色熒光蛋白(monomeric red fluorescence protein，mRFP)基因和螢火蟲熒光素酶(Luc)基因，其表達(dá)受CAG (CMV early enhancer/chicken beta actin promoter)啟動(dòng)子調(diào)控。慢病毒包裝系統(tǒng)psPAX2和pMD2.G由瑞士Didier Trono博士惠贈(zèng)。293FT細(xì)胞來源和培養(yǎng)方法等參見文獻(xiàn)［2］。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6小鼠和昆明小鼠(SPF級(jí)，6~8周齡，16~22 g)由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2006-0015］，飼養(yǎng)于SPF級(jí)屏障系統(tǒng)內(nèi)，設(shè)施使用合格證號(hào):SYXK(粵)2006-0074。C57BL/6小鼠用作以下群體：供受精卵用雌鼠和種公鼠，昆明小鼠用作以下群體：假孕母鼠和結(jié)扎雄鼠。

1.1.3 主要試劑

PCR擴(kuò)增試劑dNTP和Taq酶及限制性內(nèi)切酶等購自大連TaKaRa公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自QIAGEN公司，KSOM培養(yǎng)液和FHM操作液購自Chemicon公司，透明質(zhì)酸酶、礦物油和細(xì)胞松弛素購自Sigma公司。細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染用試劑等來源參見文獻(xiàn)［4］，其余試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口化學(xué)純或分析純。

1.1.4 主要儀器及原理

小動(dòng)物活體成像儀(即Xenogen IVIS Lumina Imaging System)為精諾真(Xenogen)公司產(chǎn)品，其主要由超低溫下的高度敏感的CCD相機(jī)及特別設(shè)計(jì)的成像暗箱、激光器、激發(fā)和發(fā)射濾光片、恒溫臺(tái)、氣體麻醉系統(tǒng)、數(shù)據(jù)采集的計(jì)算機(jī)、數(shù)據(jù)處理軟件(Living Imaging)等組成，可精確檢測并記錄這些光子［5-6］。正置熒光顯微鏡、倒置熒光顯微鏡均為尼康(Nikon)公司生產(chǎn)，冰凍切片機(jī)為萊卡(Leica)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒包裝、濃縮及鑒定

慢病毒包裝、濃縮和保存步驟和方法參見文獻(xiàn)［4］和Invitrogen公司操作手冊(cè)。經(jīng)超速離心濃縮的病毒分裝后于-80 ℃保存?zhèn)溆茫挥脻饪s后的病毒感染293FT細(xì)胞，24~48 h后熒光顯微鏡下觀察是否見紅色熒光，以確認(rèn)病毒是否成功生產(chǎn)。

1.2.2 慢病毒卵周隙注射制備RL轉(zhuǎn)基因小鼠

超數(shù)排卵后采集受精卵，然后將濃縮后的病毒注射入小鼠受精卵的卵周隙中，并將注射后狀態(tài)良好的受精卵移植進(jìn)昆明假孕母鼠輸卵管內(nèi)，仔鼠一般19.5~20.0 d后出生。假孕母鼠和結(jié)扎雄鼠制備以及超數(shù)排卵、受精卵采集、病毒卵周隙注射和受精卵移植等方法參見文獻(xiàn)［5-8］。

1.2.3 利用小動(dòng)物活體成像儀篩選與鑒定RL轉(zhuǎn)基因首建鼠

將出生幾天后的仔代乳鼠置于小動(dòng)物活體成像儀(即Xenogen IVIS Lumina Imaging System)內(nèi)，檢測RFP和Luc表達(dá)以初篩RL轉(zhuǎn)基因小鼠，并從中選出熒光強(qiáng)度適中的乳鼠，作標(biāo)記。

利用小動(dòng)物活體成像儀檢測Luc表達(dá)前，小鼠腹腔注射底物D-luciferin (0.15 mg/g)，出生幾天的小鼠不麻醉直接檢測Luc，3周齡以上小鼠檢測Luc時(shí)需先麻醉再檢測；注射底物5~10 min后，利用小動(dòng)物活體成像儀活體檢測Luc表達(dá)。

1.2.4 采用PCR進(jìn)行基因型鑒定以驗(yàn)證小動(dòng)物活體成像儀鑒定結(jié)果

在利用小動(dòng)物活體成像儀初篩和鑒定RL轉(zhuǎn)基因小鼠的基礎(chǔ)上，應(yīng)用PCR驗(yàn)證RFP和Luc陽性的小鼠基因組是否成功整合轉(zhuǎn)基因RL。

步驟與方法如下：小鼠出生3周后，剪鼠尾，采用基因組DNA 提取試劑盒(申能博彩生物科技有限公司)從潛在的RL轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠(陰性對(duì)照)鼠尾組織提取基因組DNA，操作參見試劑盒說明書和文獻(xiàn)［7］。PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因用引物，P1：5’-GGGAGCGCGTGATGAAC-3’；P2：5’-CGTTGTGGGAGGTGATGTC-3’。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性7 min；95 ℃變性50 s， 54 ℃退火50 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增后，取5 mL反應(yīng)液進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.5 RL轉(zhuǎn)基因首建鼠繁殖傳代及轉(zhuǎn)基因遺傳和表達(dá)穩(wěn)定性檢測

將RFP和Luc表達(dá)陽性及PCR陽性的首建鼠與野生型小鼠交配以傳代，獲得F1后，用小動(dòng)物活體成像儀檢測RFP和Luc是否在F1代表達(dá)，對(duì)其表達(dá)穩(wěn)定性作出判斷，并進(jìn)而間接判斷外源轉(zhuǎn)基因是否穩(wěn)定遺傳。

1.2.6 體視熒光顯微鏡檢測RL轉(zhuǎn)基因小鼠各器官RFP表達(dá)

小鼠出生>6周，深度麻醉后，用PBS自小鼠左心室注入至右心房流出，直至流出液變成無色透明后，收集主要臟器(如心臟、肺、腦、腎臟、胃、肝臟、脾臟、胸腺、小腸等)，并在體視熒光顯微鏡下檢測紅色熒光，然后取心臟、肺、腎臟和胃行冰凍切片以在組織層面檢測RFP表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 攜帶RL基因慢病毒的包裝、濃縮及成功生產(chǎn)鑒定

將pRL與病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，48 h后倒置熒光顯微鏡下可見紅色熒光，預(yù)示著轉(zhuǎn)染成功。收集的病毒上清液(滴度為5.1×106TU/mL)經(jīng)超速離心濃縮后(滴度為4.2×108TU/mL)感染293FT細(xì)胞，48 h后倒置熒光顯微鏡下可見紅色熒光，預(yù)示病毒成功生產(chǎn)。

2.2 RL轉(zhuǎn)基因小鼠的建立

本研究采用慢病毒卵周隙注射法建立RL轉(zhuǎn)基因小鼠(10~100 pL/受精卵)，示意圖參見文獻(xiàn)［2］。

移植卵周隙注射有慢病毒的125枚胚胎給6只假孕母鼠，其中4只假孕母鼠懷孕［受孕率為67% (4/6)］，共生仔鼠20只［產(chǎn)仔率為16%(20/125)］；利用小動(dòng)物活體成像儀檢測RFP和Luc表達(dá)，在蛋白水平證實(shí)20只F0代中，3只表達(dá)RFP和Luc (圖1A)；DNA水平檢測證實(shí)，3只RFP和Luc陽性小鼠基因組中確實(shí)整合有外源轉(zhuǎn)基因RL(圖1B)，預(yù)示基因型鑒定結(jié)果很好驗(yàn)證了小動(dòng)物活體成像儀篩選和鑒定結(jié)果。

A: Screening RL transgenic founders by in vivo non-invasive bioluminescence and fl uorescence imaging. Two foster mothers gave birth to 5 and 6 F0 pups, respectively; 3 RFP and Luc-positive RL transgenic mice (referred to as R1, R2 and R3) were found via RFP and Luc assay by Xenogen IVIS Lumina Imaging System 2 days after birth. Figure a and d are taken under white light which respectively represent two different litters pups delivered by two different foster mothers, while fi gure b, e and c, f were gained respectively under Luc image (after injection of luciferase substrate) and RFP image by in vivo non-invasive bioluminescence and fluorescence imaging. B: RFP- and Luc-positive founders verified for RL transgene presence by PCR analysis. Three mRFP-Luc-positive mice (R1, R2, R3) were individually analyzed by PCR for the genomic integration of transgene with tail biopsy-derived DNA from mice (R1, R2, R3). Lane M: Maker 2000; Lane PC: Positive control (pCAGRL as template); Lane NC: Negative control using genomic DNA from WT mouse as template. Data are representative of three independent PCR experiments that yield similar results.

2.3 RFP和Luc轉(zhuǎn)基因遺傳和表達(dá)穩(wěn)定性檢測

為證實(shí)首建鼠所攜帶的外源基因可否穩(wěn)定遺傳，將RFP和Luc表達(dá)陽性及PCR陽性的首建鼠R1與野生型小鼠交配以獲得F1代(圖1)。小動(dòng)物活體成像儀檢測顯示，新生的F1代小鼠中部分個(gè)體表達(dá)RFP和Luc(圖2A)，而成年小鼠也能正常表達(dá)Luc和RFP(圖2B)，這些預(yù)示外源基因RL不僅可以從一代向下一代穩(wěn)定傳遞，且能夠穩(wěn)定表達(dá)。

RFP and Luc expression in the whole-body and postnatal adult organs of RL transgenic mice was detected by the Xenogen IVIS Lumina Imaging System. A: F1 progeny inherit and express RFP and Luc transgene from founder R1. Whole-body bioluminescence and fl uorescence imaging for newborn offspring derived from the mating between founder R1 and wild-type mouse was performed. B: Whole-body bioluminescence and fl uorescence imaging for adult RL transgenic mouse (F1). The RFP- & Luc-positive RL transgenic mouse [marked by asterisk (*)] and RFP- &Luc-negative mouse [marked by pound (#)] shown in Fig. A were selected for whole-body bioluminescence and fl uorescence imaging. C: In vitro imaging of Luc and RFP expression in organs from the same mouse [marked by asterisk (*)]. The picture was taken after removing testis from the picture (B), while the picture (RFP image) was taken after removing testis and pancreas from the picture (B).

2.4 RFP和Luc轉(zhuǎn)基因在RL轉(zhuǎn)基因小鼠各器官上的表達(dá)

小動(dòng)物活體成像儀檢測離體器官Luc表達(dá)顯示：RL轉(zhuǎn)基因小鼠主要臟器(如睪丸、胰腺、腦、心、胃、肺、小腸、腎、胸腺和肝)均可見Luc信號(hào)，但不同臟器間Luc信號(hào)強(qiáng)度之間有差異(圖2C)。

體視熒光顯微鏡檢測RL轉(zhuǎn)基因小鼠各器官RFP表達(dá)顯示：RL轉(zhuǎn)基因小鼠的主要臟器如睪丸、胰腺、腦、心、胃、肺、小腸、腎、胸腺和肝均可見紅色熒光(圖3)，但不同臟器間熒光強(qiáng)度有差異，其中胰腺、腦、胃、小腸、心、睪丸和腎RFP表達(dá)水平較高，肝、肺、胸腺和脾RFP表達(dá)水平較低(圖2C)。心臟、肺、腎臟和胃行冰凍切片后，亦可在組織層面檢測到RFP表達(dá)(圖4)。

3 討 論

本研究在積極探索簡便易行的“非損傷可視外源轉(zhuǎn)基因跟蹤”策略與方法，以便替代PCR和Southern blot等傳統(tǒng)跟蹤轉(zhuǎn)基因的方法。如RL轉(zhuǎn)基因小鼠篩選與鑒定過程中，應(yīng)用小動(dòng)物活體成像儀通過活體檢測新生仔鼠整體RFP和Luc表達(dá)，進(jìn)而成功篩選并鑒定出RL轉(zhuǎn)基因小鼠，而對(duì)這些RFP和Luc陽性的個(gè)體行基因型鑒定(利用PCR技術(shù))，證實(shí)這些鼠基因組中確實(shí)整合了外源轉(zhuǎn)基因RL。至此，本研究初步建立了簡便易行的“非損傷可視外源轉(zhuǎn)基因跟蹤”策略與方法，該方法有望替代PCR和Southern blot等傳統(tǒng)跟蹤轉(zhuǎn)基因的方法。

目前除胚胎干細(xì)胞外，小鼠不同組織來源的成體干細(xì)胞均未建立成熟的體外培養(yǎng)體系，這給外源基因(包括報(bào)告基因)導(dǎo)入帶來諸多不便；為此，在進(jìn)行移植實(shí)驗(yàn)時(shí)，往往從報(bào)告基因轉(zhuǎn)基因小鼠(報(bào)告基因的表達(dá)受普遍性的無細(xì)胞或無組織特異的啟動(dòng)子調(diào)控)相應(yīng)組織(如骨髓等)中獲取報(bào)告基因標(biāo)記的待移植細(xì)胞。目前，轉(zhuǎn)基因報(bào)告小鼠主要為單報(bào)告基因，如單RFP、單Luc轉(zhuǎn)基因小鼠［2，11］，而活體內(nèi)生物發(fā)光［用熒光素酶(Luciferase，Luc)基因標(biāo)記細(xì)胞等)成像和熒光 ［熒光報(bào)告基團(tuán)(GFP和RFP等)］成像各有優(yōu)點(diǎn)，如生物發(fā)光成像靈敏度高、特異性極強(qiáng)、可精確定量和組織穿透能力強(qiáng)等，而熒光成像雖有背景噪音、靈敏度低和穿透能力弱等缺點(diǎn)，但熒光信號(hào)強(qiáng)、標(biāo)記靶點(diǎn)多樣、觀察直觀和檢測方便等［10-12］。因此，對(duì)于不同研究，應(yīng)根據(jù)生物發(fā)光成像和熒光成像各自特點(diǎn)和優(yōu)勢進(jìn)行選擇。為將生物發(fā)光和熒光的優(yōu)點(diǎn)融為一體，有研究者通過GFP轉(zhuǎn)基因小鼠和Luc轉(zhuǎn)基因小鼠交配以獲得雙報(bào)告基因(GFP和Luc)轉(zhuǎn)基因小鼠，并進(jìn)而從其骨髓中分離得到雙報(bào)告基因標(biāo)記的移植供體細(xì)胞——造血干細(xì)胞(HSCs)，以供移植實(shí)驗(yàn)來研究造血重構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)非損傷、實(shí)時(shí)和可視化體內(nèi)監(jiān)測造血重構(gòu)過程。目前，報(bào)告基因(GFP、mRFP或Luc)表達(dá)受無細(xì)胞或無組織特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因小鼠均是單報(bào)告基因的，而通過以上方法獲得雙報(bào)告基因標(biāo)記的供體移植細(xì)胞需花費(fèi)較長時(shí)間。而雙報(bào)告基因RL轉(zhuǎn)基因小鼠的成功建立將為相關(guān)研究提供雙報(bào)告基因標(biāo)記的各種移植用供體細(xì)胞，借助該類細(xì)胞有助于將生物發(fā)光、熒光兩項(xiàng)技術(shù)融為一體，雙報(bào)告基因(RFP和Luc)標(biāo)記的移植細(xì)胞較單報(bào)告基因(GFP、RFP或Luc)標(biāo)記的移植細(xì)胞在實(shí)際應(yīng)用中更具有優(yōu)勢［15-18］，如在細(xì)胞水平時(shí)，可以根據(jù)其細(xì)胞帶有的RFP來篩選，體內(nèi)跟蹤實(shí)驗(yàn)時(shí)，又可以利用其帶有的Luc報(bào)告基因進(jìn)行追蹤，特異性好，靈敏度高，組織穿透力強(qiáng)，從而充分發(fā)揮各自優(yōu)勢，更有利于實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述，本研究成功建立了RFP和Luc雙報(bào)告基因轉(zhuǎn)基因小鼠，該小鼠將為相關(guān)研究(如干細(xì)胞移植、干細(xì)胞在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用、造血重構(gòu)等)提供雙報(bào)告基因標(biāo)記的各種移植用供體細(xì)胞，借助該類細(xì)胞有助于將生物發(fā)光、熒光兩項(xiàng)技術(shù)融為一體，從而實(shí)現(xiàn)靈敏的非損傷、實(shí)時(shí)和可視化體內(nèi)跟蹤移植供體細(xì)胞及其在體內(nèi)衍生的細(xì)胞［19］。

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Generation of RFP and luciferase double transgenic mice

ZHANG Yu-qin, LIN Xiao-lin, JIA Junshuang, XIE Rao-ying, FAN Quan-rong, ZHAO Zun-lan, YANG Sheng, GAO Fei, YAO Kai-tai,XIAO Dong(Cancer Research Institute, Southern Medical University, Guangzhou Guangdong 510515, China)

XIAO Dong E-mail：xiao_d@hotmail.com

Background and purpose：Opticalin vivoimaging includes bioluminescence and fl uorescence technology. Bioluminescence technique is that cells or DNA are labeled by gene luciferase (Luc), while fl uorescence technique is marked by a fl uorescent reporter (GFP and RFP, Cyt, and dyes, etc.), then using a very sensitive optical detection equipment to directly monitor the activity and gene behavior of the cells of living organismsin vivo.Bioluminescence imaging has high sensitivity and specificity compared with fluorescence imaging, moreover,bioluminescence signal can be used for precise quantitative while fluorescence imaging has the advantages of convenient, inexpensive, intuitive, and marking targets diversely and easily accepted by the majority of researchers.The study was aimed to generate red fl uorescent protein (RFP) and Luc double transgenic mice (i.e., RL transgenic mice) by lentivirus-mediated delivery of foreign genes into zygotes.Methods：RL transgenic mice were generated by the subzonal injection of lentivirus harboring RFP and Luc gene into single-cell fertilized eggs of mice to infect fertilized eggs, and subsequently embryos infected by lentivirus were transplanted into the pseudopregnant mice to attain F0 mice, followed by screening RL transgenic mice from potential founders via RFP and Luc assay by using the Xenogen IVIS Lumina Imaging System at birth, and subsequently conf i rmed the results of RFP and Luc assay by PCR-based genotyping.Results：In our study, 125 virus-injected eggs were transplanted into 6 pseudopregnant mice to attain 20 potential transgenic founders. Three RFP- and Luc-positive mice were found via RFP and Luc assay by using the Xenogen IVIS Lumina Imaging System 2 days after birth. PCR-based genotyping indicated that RL gene actually integrated into the genome of three RL-positive F0 mice, which conf i rmed the results of RFP and Luc assay.Furthermore, RL transgene could be transmitted from founders to subsequent generation (F1 progeny). Red fl uorescence and Luc could be detected in different adult organs including testis, kidney, stomach, intestine, lung, liver, brain,thymus, spleen and heart under stereo fl uorescence microscope and/or by the Xenogen IVIS Lumina Imaging System.Conclusion：RFP and Luc double transgenic mice were successfully produced to provide a variety of dual-reporter gene markers with donor cell transplantation for follow-up study of cancer stem cells in tumor development, metastasis and hematopoietic reconstruction, and traced this donor-derived cells and cells in the body with non-sensitive damage,real-time visualizationin vivo.

RFP; Luciferase; Lentiviral vector; Cancer stem cells; Ttransgenic mice

10.3969/j.issn.1007-3969.2012.05.001

R7XXX

A

1007-3639(2012)05-0321-08

國家自然科學(xué)基金委員會(huì)-廣東省聯(lián)合基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No: u0732006)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No: 81172587；81100573)；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No: 9151063101000015)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No: 2009B060300008)；廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金(No: A2007359)；南方醫(yī)科大學(xué)優(yōu)秀中青年科技人才庫科研資助金和廣州地區(qū)科學(xué)儀器協(xié)作共用網(wǎng)專用基金(No: 2006176)。

肖東 E-mail:xiao_d@hotmail.com

2011-12-10

2012-04-30）