冠心寧注射液中5-羥甲基糠醛HPLC法限度檢查

陳 勇， 祝 明， 唐登峰， 李 正， 羅 鐳， 俞建平

（浙江省食品藥品檢驗(yàn)所，浙江杭州 310004）

冠心寧注射液中5-羥甲基糠醛HPLC法限度檢查

陳 勇， 祝 明， 唐登峰， 李 正， 羅 鐳， 俞建平

（浙江省食品藥品檢驗(yàn)所，浙江杭州 310004）

目的 建立HPLC法檢查冠心寧注射液中5-羥甲基糠醛限度的方法。方法 采用Kromasil KR100-5C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相 乙腈－0.05%三氟乙酸溶液，梯度洗脫；體積流量為0.8 mL/min；柱溫40℃，檢測波長為288 nm。結(jié)果 5-羥甲基糠醛在15.588～311.76 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=1.000 0，平均回收率為99.1%，RSD為0.8%，定量限為7 μg/mL。結(jié)論 該研究建立的方法可行，重復(fù)性好，可用于冠心寧注射液中5-羥甲基糠醛的限度控制。

冠心寧注射液；5-羥甲基糠醛；限度檢查；HPLC

冠心寧注射液是由丹參和川芎經(jīng)水提醇沉等步驟制成的中藥注射劑，具有活血化瘀，通脈養(yǎng)心的功能，臨床上主要用于冠心病心絞痛的治療［1-2］。川芎中含有較多的糖類成分，因煎煮時(shí)間過長或滅菌溫度過高等步驟后單糖易發(fā)生脫水反應(yīng)產(chǎn)生5-羥甲基糠醛。5-羥甲基糠醛是含糖輸液制品中需控制的雜質(zhì)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，5-羥甲基糠醛對人體橫紋肌和內(nèi)臟有損害，具有神經(jīng)毒性，能與人體蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生積蓄中毒。中成藥中5-羥甲基糠醛量測定已越來越引起各方的重視［3-4］，已有多個(gè)中成藥的定量測定方法報(bào)道［5-12］。冠心寧注射液收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第17冊，無5-羥甲基糠醛的限度控制檢查，目前的文獻(xiàn)中尚未見關(guān)于冠心寧注射液中5-羥甲基糠醛限度檢查的報(bào)道。本課題小組對冠心寧注射液進(jìn)行了深入研究，提出了5-羥甲基糠醛限度制定的理由，并制定了5-羥甲基糠醛的限度檢查方法，該方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，可用于冠心寧注射液中5-羥甲基糠醛的限度控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200系列高效液相色譜儀 （G 1322A脫氣機(jī)、G 1311A四元泵、G 1329A自動(dòng)進(jìn)樣儀、G 1316A柱溫箱、G 1315D二極管陣列檢測器）和 Agilent ChemStation工作站；METTLER TOLEDO AG 285型電子天平 （瑞士METTLER公司）。

1.2 試藥 5-羥甲基糠醛對照品 （批號(hào)111626-200804）由中國藥品生物制品檢定所提供。乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余試劑為分析純。冠心寧注射液樣品：全國各生產(chǎn)企業(yè)共72批，其中考察用樣品為亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)為091108。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Kromasil KR100-5C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈－0.05%三氟乙酸溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，0～65 min，乙腈由2%線性變化至30%；體積流量：0.8 mL/min；柱溫40℃；檢測波長為288 nm；進(jìn)樣量 5 μL。

2.2 供試品溶液的制備 精密量取本品2 mL，置10 mL量瓶中，加0.2%冰醋酸的10%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜 （0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對照品溶液的制備 取5-羥甲基糠醛對照品適量，加0.2%冰醋酸的10%甲醇溶液制成每1 mL含15.588 μg的溶液，即得。

2.4 系統(tǒng)適用性 在2.1項(xiàng)色譜條件下測定，結(jié)果表明理論板數(shù)按5-羥甲基糠醛峰計(jì)算大于30 000，5-羥甲基糠醛與相鄰的雜質(zhì)峰能得到基線分離。見圖1。

圖1 冠心寧注射液HPLC色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取5-羥甲基糠醛對照品溶液1，3、5、8、10、15、20 μL，注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)色譜條件測定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量 （μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程：Y=9.058X－0.983，r=0.999 9，線性范圍為 15.588～311.76 ng。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按供試品溶液的制備方法制得樣品溶液，分別于配制后0、5、12、27、29、36、41 h進(jìn)樣，測定5-羥甲基糠醛峰面積，結(jié)果峰面積RSD值為2.0%。表明樣品溶液在41 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，測定5-羥甲基糠醛峰面積，結(jié)果峰面積 RSD值為0.1%，精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 按2.1項(xiàng)下方法對同一批樣品 （批號(hào)：091108）進(jìn)行6次測定，得5-羥甲基糠醛的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為58.4 μg/g（RSD為2.2%），表明樣品的重復(fù)性良好。

2.9 定量限試驗(yàn) 因5-羥甲基糠醛屬于定量檢查項(xiàng)目，故按中國藥典規(guī)定的要求，對5-羥甲基糠醛進(jìn)行了定量限測定，取5-羥甲基糠醛對照品 （2.598 μg/mL），進(jìn)樣5 μL，記錄色譜圖，并計(jì)算其信噪比，結(jié)果信噪比為18.4，折算成信噪比為10時(shí)冠心寧注射液中含有的5-羥甲基糠醛的量為7 μg/mL，即本品的定量限為7 μg/mL。

2.10 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 采用加樣回收率試驗(yàn)法，精密量取已知量的同一批樣品 （批號(hào)：091108）適量，精密加入一定量的5-羥甲基糠醛對照品，按供試品溶液制備項(xiàng)下操作，平行操作6份，按2.1項(xiàng)色譜條件測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.11 樣品測定 按2.1項(xiàng)下方法測定了7家生產(chǎn)單位72批冠心寧注射液的5-羥甲基糠醛，最大質(zhì)量濃度為0.14 mg/mL，有3批未檢出5-羥甲基糠醛，具體見表2。

3 討論

3.1 共測定了7家生產(chǎn)單位72批冠心寧注射液的5-羥甲基糠醛，質(zhì)量濃度最大的為0.14 mg/mL，有3批未檢出5-羥甲基糠醛。其中0.05～0.14 mg/mL的樣品有17批，質(zhì)量濃度最大的2批在0.10～0.14 mg/mL之間，均為同一廠家的樣品。經(jīng)與企業(yè)溝通，該企業(yè)在生產(chǎn)過程中有熱處理的步驟，導(dǎo)致5-羥甲基糠醛量偏高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

表2 冠心寧注射液中5-羥甲基糠醛限度檢查結(jié)果

3.2 試驗(yàn)中比較了不同的流動(dòng)相系統(tǒng)，甲醇－0.1%三氟乙酸、乙腈－0.03%磷酸以及乙腈－0.05%三氟乙酸等梯度洗脫系統(tǒng)，結(jié)果對5-羥甲基糠醛的分離幾乎無影響，但考慮冠心寧注射液中其他成分的分離情況，最后選擇了乙腈－0.05%三氟乙酸溶液梯度洗脫。

3.3 試驗(yàn)中考察了方法的耐用性，比較了不同的色譜柱（Kromasil C18、Shimpack VP-ODS、Zorbax SB C18等 5 根）、流動(dòng)相酸度 （0.04%、0.05%、0.06%）、柱溫 （30℃、35℃、40℃和45℃）、體積流量 （0.6、0.7、0.8、0.9 mL/min）、儀器 （Agilent、Shimadzu、Waters），結(jié)果本方法的耐用性良好。

3.4 試驗(yàn)中采用一定質(zhì)量濃度的5-羥甲基糠醛對照品，在284 nm的波長處測定吸光度，再根據(jù)中國藥典品種葡萄糖注射液和葡萄糖氯化鈉注射液中5-羥甲基糠醛限度檢查的方法，折算成葡萄糖注射液 （500 mL∶25 g）中最大允許量為6.1 mg，葡萄糖氯化鈉注射液 （500 mL：葡萄糖25 g與氯化鈉4.5 g）中最大允許量為23.9 mg。本品用法與用量為每次20～40 mL，用5%葡萄糖注射液500 mL稀釋后靜脈滴注，按稀釋后的樣品中允許的5-羥甲基糠醛的限量不超過葡萄糖氯化鈉注射液 （500 mL∶葡萄糖25 g與氯化鈉4.5 g）計(jì)算，則本品1 mL含5-羥甲基糠醛的限量為0.445 mg，根據(jù)實(shí)際樣品測定結(jié)果，故暫定本品每1 mL含5-羥甲基糠醛不得超過0.20 mg。根據(jù)該限度，本實(shí)驗(yàn)測定的72批樣品均符合規(guī)定。

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R927.2

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1001-1528（2012）06-1190-04

2011-06-14

十一五科技支撐項(xiàng)目 （2009ZX09308－004）

陳 勇 （1970—），男，副主任中藥師，從事藥品檢驗(yàn)及標(biāo)準(zhǔn)制定工作。Tel：15958114451，E-mail：chenyong_zyj@163.com