中國水蛇同工酶生化遺傳特征的性別間比較

賈守菊，趙，沈思磊，張永普,?

(1．溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江溫州 325035；2．中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院，北京 100193)

中國水蛇同工酶生化遺傳特征的性別間比較

賈守菊1，趙2，沈思磊1，張永普1,?

(1．溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江溫州 325035；2．中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院，北京 100193)

采用聚丙烯酰胺凝膠不連續(xù)垂直平板電泳技術(shù)對中國水蛇雌雄兩性個體肌肉的蘋果酸脫氫酶（MDH）、蘋果酸酶（ME）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、酯酶（EST）、乳酸脫氫酶（LDH）、醇脫氫酶（ADH）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH）和谷氨酸脫氫酶（GDH）等9種同工酶進(jìn)行生化遺傳分析，共記錄了31個基因座位、58個等位基因，其中有16個基因座位（Mdh-1、Mdh-2、Mdh-3、Me-1、Me-2、G6pdh-3、Est-1、Est-2、Est-3、Est-4、Sod-1、Sod-2、Sod-3、Sod-4、Pod-1和Pod-2）為多態(tài)，多態(tài)座位比例（P）為51.6%．雌雄兩性的ADH和LDH兩種同工酶的酶帶表達(dá)不存在差異；其他7種酶均存在不同程度的差異．雌性個體間有3種酶（ADH、LDH和SOD）、雄性個體間有6種酶（ME、ADH、GDH、LDH、SOD和POD）在表達(dá)上基本無差異．

中國水蛇；同工酶；生化遺傳特征；性別

同工酶分析有助于研究細(xì)胞分化、物種形成過程中基因作用機理以及生物群體的遺傳進(jìn)化規(guī)律，在爬行動物種群遺傳結(jié)構(gòu)分析、進(jìn)化、系統(tǒng)分類、個體發(fā)育等方面有著廣泛的應(yīng)用[1-2]．有關(guān)蛇類同工酶研究大多集中于其種間和種內(nèi)不同組織同工酶酶譜的差異，種內(nèi)不同個體間及雌雄性別間的比較未見報道．中國水蛇（Enhydris chinensis）分布于中國的江蘇、浙江、江西、福建、臺灣、廣東、海南、廣西、湖南、湖北以及越南北部[3]．本文采用聚丙烯酰胺凝膠不連續(xù)垂直平板電泳，對中國水蛇雌雄兩性不同個體的蘋果酸脫氫酶（MDH）、蘋果酸酶（ME）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、酯酶（EST）、乳酸脫氫酶（LDH）、醇脫氫酶（ADH）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH）、谷氨酸脫氫酶（GDH）等9種同工酶進(jìn)行生化遺傳分析，旨在探討其種內(nèi)性別間的變異能力．

1 材料和方法

1.1 樣本采集和保存

中國水蛇于2009年7月和2011年7月采自浙江省平陽縣桃源鄉(xiāng)．將水蛇活體帶回實驗室，挑選健康的雌雄個體各10條．經(jīng)性別鑒定和電子天平稱重后，置于冰盤中，進(jìn)行活體解剖，取出肌肉組織，逐條裝袋稱重，保存于-70℃冰箱備用．

1.2 樣本制備

取不同個體的肌肉組織，按1∶2（質(zhì)量∶體積）比例加入酶提取液[100 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH7.6），內(nèi)含40 g蔗糖、0.106 6 g抗壞血酸和0.073 3 g L-半胱氨酸]，在冰浴下置勻漿器中研磨，勻漿于4℃冷凍離心機中以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 min，取上清液分裝，50 μL/管，置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

1.3 電 泳

采用聚丙烯酰胺凝膠不連續(xù)垂直平板電泳[4]，凝膠濃度及緩沖系統(tǒng)見表1．儀器為北京六一儀器廠DYY-12C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和DDY-III-28A型垂直電泳槽，凝膠厚度1.5cm，每管加樣量隨同工酶不同而不等（30 – 50 μL），以溴酚藍(lán)作前沿指示劑，于4℃冰箱中進(jìn)行電泳．開始電泳時樣品槽穩(wěn)定電流為1 mA/管，當(dāng)溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠界面時樣品槽穩(wěn)定電流為2 mA/管．

表1 凝膠濃度及緩沖系統(tǒng)

以上采用相同的電極緩沖液[Tris-Gly緩沖液（pH8.3），6 g Tris，28.8 g Gly，定容至1 L，用時稀釋10倍]進(jìn)行電泳．電泳時間為4 h．

1.4 染 色

當(dāng)溴酚藍(lán)指示帶距末端約1cm處時結(jié)束電泳，并立即拆板，小心地將凝膠取出，用重蒸水清洗2遍，再放入配制好的染色液中進(jìn)行染色．染色方法基本參照文獻(xiàn)[5]．

1.5 結(jié)果處理

染色后的凝膠板立即拍照，并繪制電泳結(jié)果模式圖，計算各酶帶的相對遷移率．

1.5.1 酶位點與等位基因編號

基因座位和等位基因的命名基本采用Shaklee等[6]推薦的方法予以編號，以同工酶的縮寫字母代表等位基因，小寫字母代表編碼基因．各座位按其編碼酶從陰極到陽極的遷移順序命名（1、2、3、…），若該座位有1個以上等位基因，各等位基因按英文字母順序命名（a、b、c、…）．1.5.2 數(shù)據(jù)分析

本實驗以中國水蛇中9種同工酶的酶譜為基礎(chǔ)對其進(jìn)行酶譜相似系數(shù)和多態(tài)位點比例的計算．酶譜相似系數(shù)（C）指2個樣品之間共同具有的酶帶數(shù)與2個樣品所具有酶帶數(shù)之和的比值．其計算公式：C = [2 × W / (a + b)] × 100．其中：W表示樣品A和樣品B中相同的酶帶數(shù)；a和b分別表示樣品A和樣品B的酶帶數(shù)．若樣品個體間在同工酶的表達(dá)上不存在差異，則酶譜相似系數(shù)不做計算．基因變異度量用多態(tài)位點比例（P）表示，P =（多態(tài)位點數(shù)/總位點數(shù)）× 100%．

2 結(jié)果與分析

2.1 酶譜分析

2.1.1 蘋果酸脫氫酶（MDH：E.C.1.1.1.37）酶譜分析

中國水蛇雌雄個體MDH同工酶酶譜見圖1，相似系數(shù)總和見表2．

MDH為二聚體酶．雌雄不同個體的酶譜均顯示了3個活性區(qū)域，表示在中國水蛇中MDH 由3個基因座位編碼，均為多態(tài)，共編碼6 – 9條酶帶．Mdh-1座位基因型為a/a、b/b和c/c，其中雌性大多個體缺失a/a，雄性僅2個個體缺失a/a；b/b和c/c雌雄個體表達(dá)無差異．Mdh-2座位基因型分別為a/a和b/b，雌性個體普遍缺失b/b，雄性個體表達(dá)無差異；a/a雌雄個體表達(dá)無差異．Mdh-3座位基因分別為a/a、b/b和c/c，雌性3個個體缺失a/a，雄性個體表達(dá)無差異；b/b和c/c雌雄個體表達(dá)無差異．中國水蛇雌性個體間MDH同工酶的表達(dá)上存在一定程度的差異，而雄性個體間較穩(wěn)定；表明雌雄在MDH同工酶的表達(dá)上呈現(xiàn)一定程度差異．

圖1 中國水蛇蘋果酸脫氫酶同工酶譜及模式圖①編號1 – 10為雌性個體, 11 – 20為雄性個體. 下同.

2.1.2 蘋果酸酶（ME：E.C.1.1.1.40）酶譜分析

中國水蛇雌雄個體ME同工酶酶譜見圖2，相似系數(shù)總和見表2．

ME為四聚體酶．雌雄不同個體酶譜均顯示了2個活性區(qū)域，表示在中國水蛇中ME均由2個基因座位編碼，均為多態(tài)，共編碼5 – 6條酶帶．Me-1基因型為a/a、b/b、c/c、d/d和e/e．其中a/a和b/b雌雄均無缺失，小部分雌性個體及全部的雄性個體缺失c/c，除雌性個體4缺失d/d外，其余雌雄個體的d/d和e/e均無缺失現(xiàn)象．Me-2座位基因型為a/a和b/b，雌性個體大多缺失a/a且個體6還缺失b/b，雄性個體無缺失現(xiàn)象且表達(dá)無差異．由此分析得，中國水蛇不同雌性個體在該同工酶的表達(dá)上存有一定差異而雄性個體在該酶的表達(dá)上基本無差異；表明雌雄間在ME同工酶的表達(dá)上呈現(xiàn)一定程度差異．

圖2 中國水蛇蘋果酸酶同工酶譜及模式圖

2.1.3 醇脫氫酶（ADH：E.C.1.1.1.1）酶譜分析

中國水蛇雌雄個體ADH同工酶酶譜見圖3．

ADH為二聚體酶．雌雄不同個體的酶譜均顯現(xiàn)了3個活性區(qū)域，表示在中國水蛇中ADH由3個基因座位編碼，均為單態(tài)純合，基因型均為a/a，雌雄20個個體的表達(dá)均無缺失，其中Adh-3 a/a酶活性相對稍強．中國水蛇雌雄不同個體間和雌雄間在該同工酶的表達(dá)上無差異．

圖3 中國水蛇醇脫氫酶同工酶譜及模式圖

2.1.4 谷氨酸脫氫酶（GDH：C.E.1.4.1.2）酶譜分析

中國水蛇雌雄個體GDH同工酶酶譜見圖4，相似系數(shù)總和見表2．

GDH為二聚體酶．雌雄不同個體的酶譜均顯現(xiàn)了3個活性區(qū)域，表示在中國水蛇中GDH由3個基因座位編碼，均為單態(tài)純合，共編碼3條酶帶．除雌性個體6缺失Gdh-3 a/a外，其余雌雄不同個體均無缺失現(xiàn)象，GDH酶譜表型基本相同．由此分析得，中國水蛇雌性個體在該同工酶表達(dá)略有差異而雄性個體在該同工酶的表達(dá)上基本無差異．

圖4 中國水蛇谷氨酸脫氫酶同工酶譜及模式圖

2.1.5 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH：E.C.1.1.1.49）酶譜分析

中國水蛇雌雄個體G6PDH同工酶酶譜見圖5，相似系數(shù)總和見表2．

G6PDH為二聚體酶．雌雄不同個體的酶譜均顯示了3個活性區(qū)域，表示雌雄個體的G6PDH均由3個基因座位編碼．G6pdh-1和G6pdh-2座位均為單態(tài)純合，雌性個體這兩個座位均無缺失，雄性個體中的11、12、13、15、16和20缺失G6pdh-1座位，G6pdh-2雄性個體亦無缺失．G6pdh-3位點為多態(tài)，編碼1 – 2條酶帶，雌性個體8及雄性個體17、18和19均缺失b/b．由此分析得，中國水蛇在該同工酶表達(dá)上，雌性個體間不存在明顯差異，雄性個體間具一定差異；雌雄總體間也具一定差異．

圖5 中國水蛇葡萄糖-6-磷酸脫氫酶同工酶譜及模式圖

2.1.6 酯酶（EST：E.C.3.11.1.1）酶譜分析

中國水蛇雌雄個體EST同工酶酶譜見圖6，相似系數(shù)總和見表2．

雌雄不同個體的酶譜均顯示了4個活性區(qū)域，表示中國水蛇中EST均由4個基因座位編碼，均為多態(tài)，其中Est-4位點編碼的酶活性相對較強．Est-1和Est-2座位各編碼2條酶帶，基因型均為a/a和b/b，雌雄不同個體間和雌雄總體間的表達(dá)均無差異，亦無缺失．Est-3座位編碼3 – 4條酶帶，具4個基因型：a/a、b/b、c/c和d/d，雌性個體全部缺失a/a，不同個體間表達(dá)無差異；雄性中除個體12外均缺失a/a，個體12缺失c/c而其余個體則不缺失，故雄性中除個體12外，其余不同個體的表達(dá)無差異．Est-4座位編碼1 – 2條酶帶，基因型為a/a和b/b．雌性個體中有半數(shù)缺失a/a，雄性中除個體12外均缺失a/a．由此分析得，中國水蛇在EST同工酶的表達(dá)上，雌雄不同個體間具一定差異，相對而言，雄性個體間除個體12外其余基本無差異，雌性個體間差異稍大；雌雄總體間亦有一定差異．

圖6 中國水蛇酯酶同工酶譜及模式圖

2.1.7 乳酸脫氫酶（LDH：E.C.1.1.1.27）酶譜分析

中國水蛇雌雄個體LDH同工酶酶譜見圖7．

LDH為四聚體酶．不同雌雄個體的酶譜均顯示了1個活性區(qū)域，表示在中國水蛇中LDH由1個基因座位編碼，共編碼5條酶帶，基因型均為a/a、b/b、c/c、d/d和e/e，20個個體均無缺失．中國水蛇雌雄個體間和雌雄總體間在該同工酶表達(dá)上無差異．

圖7 中國水蛇乳酸脫氫酶同工酶譜及模式圖

2.1.8 超氧化物歧化酶（SOD：E.C.1.1.1.1）酶譜分析

中國水蛇雌雄個體SOD同工酶酶譜見圖8．

SOD為二聚體酶．不同雌雄個體的酶譜均顯示了4個活性區(qū)域，表示在中國水蛇中SOD由4個基因座位編碼，均為多態(tài)．Sod-1和Sod-2分別編碼3條酶帶，基因型均為a/a、b/b和c/c，雌雄不同個體均無缺失，表達(dá)無差異．Sod-3編碼2 – 3條酶帶，基因型為a/a、b/b和c/c．其中雌性個體全部缺失c/c，雌性及雄性不同個體間的表達(dá)亦無差異．Sod-4座位編碼2條酶帶，基因型為a/a和b/b，雌雄不同個體均無缺失，表達(dá)也無差異．因此，中國水蛇雌雄個體間在該同工酶表達(dá)上不存有差異，而雌雄總體間在該同工酶表達(dá)稍有差異，故譜相似系數(shù)不做計算．

圖8 中國水蛇超氧化物歧化酶同工酶譜及模式圖

2.1.9 過氧化物酶（POD：E.C.1.11.1.7）酶譜分析

中國水蛇雌雄個體POD同工酶酶譜見圖9，相似系數(shù)總和見表2．

POD為二聚體酶．不同雌雄個體的酶譜顯示均有4個活性區(qū)域，表示在中國水蛇中POD由4個基因座位編碼， Pod-1和Pod-2座位均為多態(tài)．其中，Pod-1座位編碼3條酶帶，基因型為a/a、b/b和c/c，雌性個體3缺失該基因座位，其余雌雄個體的表達(dá)都沒有差異．Pod-2座位編碼1 – 2條酶帶，基因型分別為為a/a和b/b，雄性個體均缺失b/b，雌雄不同個體間表達(dá)亦無差異．Pod-3 和Pod-4基因座位各編碼1條酶帶，均為單態(tài)純合，其中Pod-3為雄性個體所特有．由此分析得，雌性中國水蛇除個體3外在該同工酶的表達(dá)上不存在差異，雄性不同個體間不存在差異，而雌雄總體間具一定差異．

圖9 中國水蛇過氧化物酶同工酶譜及模式圖

表2 同工酶譜相似系數(shù)總和

15 986.66 100.00 100.00 885.72 982.35 100.00 16 986.66 100.00 100.00 852.39 982.35 100.00 17 986.66 100.00 100.00 785.73 982.35 100.00 18 986.66 100.00 100.00 785.73 982.35 100.00 19 986.66 100.00 100.00 785.73 982.35 100.00 20 986.66 100.00 100.00 885.72 982.35 100.00

2.2 多態(tài)座位分析

由以上數(shù)據(jù)綜合分析得，中國水蛇群體9種同工酶共記錄了31個基因座位、58個等位基因，其中有16個基因座位（Mdh-1、Mdh-2、Mdh-3、Me-1、Me-2、G6pdh-3、Est-1、Est-2、Est-3、Est-4、Sod-1、Sod-2、Sod-3、Sod-4、Pod-1和Pod-2）為多態(tài)，具體數(shù)據(jù)信息見表3．多態(tài)座位比例（P）為51.6﹪．以上現(xiàn)象說明中國水蛇中變異現(xiàn)象較為普遍．

表3 多態(tài)座位與等位基因統(tǒng)計

3 討 論

蛇類LDH和EST兩種同工酶具有種間差異性和組織特異性[7-11]，這些研究認(rèn)為酶在不同種間表達(dá)的差異可作為識別物種的生化指標(biāo)，而酶表達(dá)的組織特異性說明了不同組織在代謝上的差異．蛇類不同生理期的同工酶表達(dá)存在種間差異，任文華等[12]認(rèn)為紅點錦蛇（Elaphe rufodorsata）肝和骨骼肌中的LDH在活動期和冬眠期具有明顯差異，而黑眉錦蛇（Elaphe taeniura）和赤鏈蛇（Dinodon rufozonatum）則未表現(xiàn)出明顯變化．由于LDH在糖代謝過程中的重要作用，其研究為探討動物冬眠時期的糖代謝規(guī)律提供一定的依據(jù)．

中國水蛇雌雄兩性肌肉的ADH和LDH兩種同工酶的酶帶表達(dá)不存在差異，雌性個體的SOD、雄性個體的ME、GDH、SOD和POD表達(dá)上基本無差異；但雌性個體間的MDH和ME、雄性個體間的G6PDH存在一定程度的差異．說明中國水蛇個體間及雌雄間均具一定的遺傳差異，具一定的遺傳變異能力．

許多研究表明，人工繁殖群體遺傳變異水平要低于野生群體水平[13-16]．中國水蛇肌肉9種同工酶的多態(tài)座位比例（P）達(dá)51.6﹪，在人工養(yǎng)殖過程中，養(yǎng)殖群體基因庫將不可避免地會喪失某些特定的等位基因．因此，中國水蛇人工養(yǎng)殖時，親本數(shù)量要大，并以自然種群定期更換或者補充繁殖用的親本．這些措施有助于保持乃至增加中國水蛇人工繁殖種群遺傳變異性．

同工酶對中國水蛇生化遺傳結(jié)構(gòu)的研究以及對其進(jìn)行變異分析，將在一定程度上有助于對中國水蛇遺傳多樣性的全面了解，對中國水蛇種群的人工養(yǎng)殖和物種資源的合理開發(fā)，具有重要的意義．

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Comparison of Biochemical and Genetic Characteristics in Male and Female Enhydris chinensis

JIA Shouju1, ZHAO Bo2, SHEN Silei1, ZHANG Yongpu1
(1. College of Life and Environmental Sciences, Wenzhou University, Wenzhou, China 325027; 2. College of Biological Sciences, China Agricultural University, Beijing 100193)

By using isozyme electrophoresis on vertical gradient gel of polyacrylamide, nine isozymes [Malate Dehydrogenase (MDH), Malic Enzyme (ME), Superoxide Dismutase (SOD), Peroxidase (POD), Esterase (EST), Lactate Dehydrogenase (LDH), Alcohol Dehydrogenase (ADH), Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase (G6PDH), and Glutamate Dehydrogenase (GDH)] of different individuals of male and female Enhydris chinensis had been analyzed. These isozymes were encoded by 31 allozyme loci and 58 alleles, 16 loci of which were polymorphic: Mdh-1, Mdh-2, Mdh-3, Me-1, Me-2, G6pdh-3, Est-1, Est-2, Est-3, Est-4, Sod-1, Sod-2, Sod-3, Sod-4, Pod-1 and Pod-2. The percentage of polymerphic loci was 51.6%. The results showed that there are no differences in the expressions of ADH and LDH between the male and female Enhydris chinensis with the other seven isoenzymes having differences to different degrees while there are no differences in the expression of ADH, LDH and SOD among the female Enhydris chinensis and no differences in the expression of ME, ADH, GDH, LDH, SOD and POD among the male Enhydris chinensis.

Enhydris chinensis; Isozyme; Biochemical and Genetic Characteristics; Sex

Q55

A

1674-3563(2012)05-0008-10

10.3875/j.issn.1674-3563.2012.05.002 本文的PDF文件可以從xuebao.wzu.edu.cn獲得

(編輯：王一芳)

2012-04-25

賈守菊(1956- )，女，北京人，副教授，學(xué)士，研究方向：生理生化．? 通訊作者，zhangypu@126.com