煙田雜草小薊銹病菌遺傳多態(tài)性的RAPD分析

張峻銓，時(shí) 焦*，韋建玉，孟 坤

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，南寧 530001）

小薊又稱刺兒菜[Cephalanoplos segetum（Bunge）Kitam.][1-2]是我國(guó)煙田的主要雜草之一[3]。小薊與其他煙田雜草一樣與煙株競(jìng)爭(zhēng)水、肥和空間，直接影響煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量[4]。目前煙田雜草防除由人工除草向化學(xué)除草為主的方向發(fā)展，化學(xué)除草劑的大量使用阻礙了無公害煙葉乃至有機(jī)煙葉的生產(chǎn)。因此，科學(xué)工作者正在探索安全有效的雜草防除方法，近年來真菌除草劑成為雜草生物防治最為活躍的研究領(lǐng)域，尤其是對(duì)雜草致病銹菌的研究利用。澳大利亞首先利用銹菌（Puccinia chondrillina）成功防治雜草粉苞苣（Chondrilla juncea）[5]，之后印度也研究利用柄銹菌屬的真菌（Puccinia romagnoliana Marie& Sacc.）來控制桑樹地的莎草科雜草香附子（Cyperu srotundus L.）[6]，澳大利亞還利用柄銹菌屬真菌（Puccinia lagenophorae）防除胡蘿卜田雜草歐洲千里光（Senecio vulgaris L.）[7]，美國(guó)開展了利用縱溝柄銹菌（Puccinia canalicutata）防治稻田莎草（Cyperus esculentus）等雜草的研究[8]。

目前人們已對(duì)多種植物病原真菌的遺傳多態(tài)性進(jìn)行了研究，但尚未對(duì)雜草病原菌薊柄銹菌（P.obtegens）的遺傳多態(tài)性開展研究。為了對(duì)沒有任何遺傳信息的薊柄銹菌開展遺傳多態(tài)性研究，我們選用了 RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）分子標(biāo)記技術(shù)。

2006年在山東青島地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)感染薊柄銹菌（P.obtegens）的小薊，隨后，在北京、陜西、河南、山西等省、市也有發(fā)現(xiàn)。染病小薊葉片壞死、枯焦、植株矮化、不能正常開花結(jié)籽，重者死亡[4]。研究還發(fā)現(xiàn)薊柄銹菌夏孢子萌發(fā)的最適溫度為15～22℃；濕度為76%～100%；夏孢子萌發(fā)對(duì)光照不敏感[9]。本研究將來自不同地區(qū)、不同孢子類型和同一地點(diǎn)不同采集時(shí)間的薊柄銹菌（P.obtegens）作為試驗(yàn)材料，對(duì)其遺傳多態(tài)性進(jìn)行初步探索。目前我們還在大薊[Cephalanoplos setosum （Willd.）Kitam.]上發(fā)現(xiàn)了孢子形態(tài)類似于薊柄銹菌的銹菌，因此對(duì)其夏孢子DNA也進(jìn)行了RAPD引物擴(kuò)增，并與侵染小薊的薊柄銹菌的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行了比較，以便為雜草小薊生防菌的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與供試樣品

試驗(yàn)中所用10 bp大小的隨機(jī)引物、dNTPs、Taq酶、10×Reaction Buffer均購(gòu)自Invitrogen公司；DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。

試驗(yàn)于 2009—2011年在全國(guó)多個(gè)地區(qū)進(jìn)行樣品采集，包括北京、臨沂、日照、青島、泰安，共獲得25個(gè)樣本。試驗(yàn)用夏孢子樣品分為3組：來自不同地區(qū)的9個(gè)夏孢子樣品Po1～Po9；同一地點(diǎn)（青島嶗山）不同孢子類型及寄主的 9個(gè)樣品Po10～Po18，以及同一地點(diǎn)（青島嶗山）不同時(shí)間于小薊上采集的 7個(gè)夏孢子樣品 Po19～Po25（表1）。將從田間采集的薊柄銹菌（P.obtegens）樣品首先進(jìn)行單胞分離純化與病原鑒定，然后接種小薊進(jìn)行人工繁殖，獲得大量夏孢子。對(duì)獲得的不同樣品的夏孢子單獨(dú)提取總DNA，并用于PCR擴(kuò)增和指紋圖譜分析。

表1 不同來源的25個(gè)夏孢子樣品Table1 25 samples from different sources

1.2 DNA的提取

夏孢子研磨參照孫仲桂等[10]的方法，并進(jìn)行了略微修改。首先稱取30 mg夏孢子裝于1.5 mL離心管中，并加入10顆直徑為3～4 mm的石英砂，而后加入少量液氮，立即蓋上蓋子，避免孢子遇冷噴出，待孢子完全冰凍，將離心管置于渦旋儀上震蕩1～2 min，使孢子充分磨碎。而后，立即用 DNA提取試劑盒對(duì)研磨充分的夏孢子粉末提取基因組DNA。具體步驟按天根生化科技有限公司DNA提取試劑盒中介紹的進(jìn)行。

1.3 RAPD分析

參考仲軍等[11]的方法，選擇25 μL的RAPD反應(yīng)體系：10×Reaction Buffer 2.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）2 μL，模板 DNA 1 μL，引物 1 μL，Taq酶（5 u/μL）0.25 μL，ddH2O 18.25 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94 ℃ 30 s，37℃ 45 s，72 ℃ 70 s，共44個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。最后，將RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像系統(tǒng)記錄RAPD譜型。

隨機(jī)選擇出 Po1、Po11、Po17進(jìn)行混合作為PCR反應(yīng)模板，從Invitrogen公司生產(chǎn)的S1～S50的 50條寡聚核苷酸隨機(jī)引物中篩選出了擴(kuò)增條帶數(shù)多且清楚的 15條隨機(jī)引物，用于試驗(yàn)樣品全基因組DNA遺傳標(biāo)記和指紋圖譜分析（表2）。

表2 選用引物的堿基序列和擴(kuò)增的DNA片段數(shù)Table2 The selected 15 primer sequences and number of fragments amplified with the 15 primers

1.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的分析

電泳獲得的全基因組DNA擴(kuò)增圖譜中每一條RAPD譜帶的有無作為統(tǒng)計(jì)參數(shù)，在相同DNA擴(kuò)增片段遷移位置（相同分子量水平）上對(duì)這些多態(tài)性擴(kuò)增條帶的有（記為 1）或無（記為 0）進(jìn)行編碼，并制成二元矩陣，在重復(fù)擴(kuò)增過程中穩(wěn)定出現(xiàn)的帶無論強(qiáng)弱均記為1[12-14]。最后利用SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行UPGMA（非加權(quán)類平均法）聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)樹狀圖。

2 結(jié) 果

2.1 不同來源樣品的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析結(jié)果

利用選定的 15條寡聚核苷酸隨機(jī)引物對(duì)供試的3組共25個(gè)樣品進(jìn)行擴(kuò)增，獲得大量的DNA指紋圖譜。表2顯示了供試15個(gè)隨機(jī)引物對(duì)25個(gè)供試樣品的遺傳標(biāo)記結(jié)果。供試 15個(gè)引物所標(biāo)出的DNA指紋總譜帶數(shù)為204條，多態(tài)性譜帶數(shù)為160條，多態(tài)檢測(cè)率為78.4%，其標(biāo)記出的擴(kuò)增片段分子量位于0.25～3 kb之間。結(jié)果表明，供試樣品表現(xiàn)出豐富的遺傳多態(tài)性。

從獲得的大量DNA指紋圖譜中選擇出比較有代表性的結(jié)果進(jìn)行介紹：引物 S6擴(kuò)增圖譜表明，來自不同地點(diǎn)的 Po1～Po9樣品的擴(kuò)增片段數(shù)目存在明顯差異，且具有一定數(shù)量的特異性片段（圖1）；引物S45擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)整體觀察，孢子類型為冬孢子的 Po10～Po12樣品之間明顯相似，而與其他樣品之間存在明顯差異，寄主為大薊的 Po13～Po15樣品之間明顯相似，而與其他樣品之間存在明顯差異（圖2）；引物S6擴(kuò)增出的同一地點(diǎn)不同時(shí)間采集的 Po19～Po25樣品結(jié)果之間，擴(kuò)增片段的大小與數(shù)目也存在一定的差異（圖3）。

圖1 引物S6對(duì)不同地區(qū)的9個(gè)樣品全基因組DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR products amplified by primer S6 against genomic DNA of 9 samples from different locations

圖2 引物S45對(duì)不同寄主與孢子類型的9個(gè)樣品全基因組DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR products amplified by primer S45 against genomic DNA of 9 samples from different spore types and hosts

2.2 通過聚類分析顯示的遺傳分化

圖3 引物S6對(duì)不同采集時(shí)間的7個(gè)樣品全基因組DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR products amplified by primer S6 against genomic DNA of 7 samples collected at diferent times

圖4結(jié)果表明，把不同地區(qū)的9個(gè)樣品劃分為3個(gè)遺傳聚類組（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），來源于北京平谷（Po1）的樣品單獨(dú)聚至遺傳聚類組Ⅰ中，來源于山東臨沂（Po2，Po3，Po8）的樣品聚至同一聚類組中，來源山東青島地區(qū)（Po4，Po6，Po7）的樣品也聚至同一聚類組中，分析表明，采集地點(diǎn)相近的樣品聚至同一遺傳聚類組的概率較大。從圖5可知，孢子類型為冬孢子的3個(gè)樣品Po10、Po11、Po12聚至遺傳聚類組Ⅰ中，寄主為大薊的 3個(gè)樣品 Po13、Po14、Po15，聚至遺傳聚類組Ⅲ中。分析表明，不同孢子類型的樣品間存在明顯差異，并且大薊上采集的樣品和小薊上采集的樣品間也存在明顯差異。圖6表明，不同時(shí)間采集的各樣品中4月采集的樣品Po19單獨(dú)聚為一類，5月、6月采集的樣品Po20、Po21聚至同一遺傳聚類組中，7～11月采集的樣品Po22～Po25聚至同一聚類組中，分析表明，采集時(shí)間相近的樣品聚類至同一遺傳聚類組的概率較大。樣品遺傳物質(zhì)DNA的變異和突變與樣品來源地、寄主、孢子類型以及采集時(shí)間存在一定的相關(guān)性。

圖4 利用UPGMA法對(duì)圖1的9個(gè)樣品基因組構(gòu)建分子樹狀圖Fig.4 Molecular phylogenetic tree of 9 samples based on Fig.1 by UPGMA

圖5 利用UPGMA法對(duì)圖2的9個(gè)樣品基因組構(gòu)建分子樹狀圖Fig.5 Molecular phylogenetic tree of 9 samples based on Fig.2 by UPGMA

圖6 利用UPGMA法對(duì)圖3的7個(gè)樣品基因組構(gòu)建分子樹狀圖Fig.6 Molecular phylogenetic tree of 7 samples based on Fig.3 by UPGMA

3 討 論

利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)3組薊柄銹樣品親緣關(guān)系的分析表明，供試樣品具有豐富的遺傳多態(tài)性，樣品的親緣關(guān)系與來源地、孢子類型以及采集時(shí)間存在一定的相關(guān)性。大薊上采集的樣品和小薊上采集的樣品間RAPD譜帶存在明顯的差異，這說明大薊與小薊上的銹菌很可能在分類上存在差異，這有待進(jìn)一步的研究。

目前，人們對(duì)薊柄銹菌（P.obtegens）的研究極少，對(duì)其生理小種的劃分、以及親緣關(guān)系的研究還沒有開展，因此，本研究利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)遺傳背景不同的薊柄銹樣品間的親緣關(guān)系進(jìn)行了初步的分析和探索。有關(guān)薊柄銹菌生理小種的劃分及不同生理小種致病力分化的RAPD分子標(biāo)記差異，還有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

本研究通過聚類分析表明，三組薊柄銹樣品在很小的遺傳距離內(nèi)就能進(jìn)行分別聚類，說明RAPD分子標(biāo)記在薊柄銹菌的劃分與鑒定上具有很高的靈敏度與準(zhǔn)確性。且來源地越靠近、孢子類型相同、采集時(shí)間越接近的樣品親緣關(guān)系越相近。

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