新生幼鼠缺血缺氧性腦損傷模型的實(shí)驗(yàn)研究①

陳剛，王偉哲，陳明釗，劉偉，高峰，支宏，錢心煒，趙麗輝

·基礎(chǔ)研究·

新生幼鼠缺血缺氧性腦損傷模型的實(shí)驗(yàn)研究①

陳剛1，王偉哲2，陳明釗1，劉偉3a，高峰3a，支宏1，錢心煒1，趙麗輝3b

目的探討缺血缺氧腦損傷的新生鼠功能及形態(tài)學(xué)改變情況。方法出生7 d的健康W istar幼鼠25只，分為對照組(n= 12)和模型組(n=13)。模型組結(jié)扎一側(cè)頸總動脈，置8%氧氣、92%氮?dú)馊毖跸鋬?nèi)2 h，對照組切開幼鼠頸部皮膚后縫合，不置于缺氧環(huán)境。出生4周時(shí)進(jìn)行行為學(xué)、水迷宮及病理學(xué)檢測。結(jié)果模型組后足重復(fù)間距長于對照組(P＜0.05)，平衡木通過時(shí)間明顯長于對照組(P＜0.01)；水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期明顯長于對照組(P＜0.01)。大體觀察發(fā)現(xiàn)，模型組損傷側(cè)腦組織體積變小、萎縮。HE染色發(fā)現(xiàn)，損傷側(cè)腦室周圍細(xì)胞腫脹，細(xì)胞數(shù)量較對側(cè)少；損傷側(cè)大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞明顯減少，神經(jīng)細(xì)胞變性壞死，膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生。結(jié)論應(yīng)用一側(cè)頸總動脈結(jié)合缺氧的方法可復(fù)制新生乳鼠缺血缺氧模型。

缺血缺氧腦損傷；動物模型；行為學(xué)；水迷宮實(shí)驗(yàn)；病理；大鼠

[本文著錄格式]陳剛，王偉哲，陳明釗，等.新生幼鼠缺血缺氧性腦損傷模型的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2012,18 (7):612-614.

小兒腦癱是指出生前及出生后1個(gè)月內(nèi)因各種原因所致的非進(jìn)行性腦損傷，主要表現(xiàn)為中樞性運(yùn)動障礙及姿勢異常，同時(shí)常伴有智力發(fā)育遲緩、學(xué)習(xí)困難、行為和情感異常等障礙[1-4]。國內(nèi)外報(bào)道小兒腦癱并發(fā)智力障礙的發(fā)病率為60%～75%[5-7]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用一側(cè)頸總動脈結(jié)合缺氧的方法制作新生乳鼠缺血缺氧腦損傷動物模型，觀察其行為學(xué)、學(xué)習(xí)記憶功能及腦組織病理變化，探討新生乳鼠缺血模型的評價(jià)方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及儀器 出生7 d的健康W istar幼鼠25只，體重13～15 g，清潔級，雌雄不限，購自新疆地方病研究所動物中心，許可證號：SCXK(新) 2003-0002。飼養(yǎng)條件為室溫(23±2)℃，光照控制12 h (7:00 a.m.～7:00 p.m.)，自由飲食水。實(shí)驗(yàn)動物缺氧箱：上海兒科醫(yī)學(xué)研究所；OX/11型測氧儀：上海昶艾電子科技有限公司；手術(shù)顯微鏡：鎮(zhèn)江中天光學(xué)儀器有限責(zé)任公司；顯微神經(jīng)外科手術(shù)器械、恒溫水浴箱。

本實(shí)驗(yàn)研究符合動物保護(hù)委員會要求，實(shí)驗(yàn)中盡可能減少使用動物的數(shù)量和減輕動物的痛苦。

1.2 腦損傷模型的制作及試驗(yàn)分組 將以上動物隨機(jī)分為對照組(n=12)和模型組(n=13)。模型組生后7 d異氟醚麻醉，消毒，手術(shù)顯微鏡下行頸正中縱切口，仔細(xì)分離一側(cè)頸總動脈后以6-0絲線雙重結(jié)扎頸總動脈并離斷，縫合皮膚切口。術(shù)后恢復(fù)2 h后放置于37℃恒溫，8%氧氣+92%氮?dú)馊毖跸渲? h。對照組麻醉后僅行頸正中切口，然后縫合切口。完全復(fù)蘇后放回母鼠身邊自由飲食水。手術(shù)、幼鼠缺氧及復(fù)蘇過程中保持局部環(huán)境溫度35℃～37℃。

1.3 腦損傷模型的評價(jià)

1.3.1 神經(jīng)行為學(xué)評價(jià) 根據(jù)Catter等[8]的方法，于出生后4周，分別進(jìn)行平衡木試驗(yàn)、足印重復(fù)間距試驗(yàn)，觀察平衡木通過時(shí)間和后足重復(fù)間距，每只觀察3次。

1.3.2 M orris水迷宮 于出生后4周進(jìn)行。記錄實(shí)驗(yàn)鼠從入水至爬上隱匿性逃逸平臺的時(shí)間，即逃逸潛伏期(s)。實(shí)驗(yàn)過程中保持實(shí)驗(yàn)室的光線、環(huán)境布局不變及周圍環(huán)境安靜。

1.3.3 病理檢查 完成行為學(xué)檢測后，實(shí)驗(yàn)鼠腹腔麻醉，活體心臟灌注，取腦組織固定，大體觀察；石蠟包埋、切片，行HE染色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用正態(tài)檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，顯著性水平α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)行為學(xué)觀察結(jié)果 足印重復(fù)間距試驗(yàn)顯示，模型組右側(cè)前后肢足印重復(fù)性差，重復(fù)間距大于對照組(P＜0.05)。平衡木試驗(yàn)顯示，模型組動物在通過平衡木橫桿時(shí)，神態(tài)遲疑不定，探索行為較多；雙側(cè)后肢關(guān)節(jié)活動僵硬，右側(cè)更明顯；協(xié)調(diào)能力差。通過平衡木時(shí)間明顯長于對照組(P＜0.01)。見表1。

2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 第1次訓(xùn)練時(shí)，各組大鼠先繞池壁快速游動，航行沒有方向性、目標(biāo)性。對照組經(jīng)過幾次嘗試后，開始以對角線在水池中航行，第1天后以縮小圓圈的方式搜索平臺，并很快找到平臺，運(yùn)動軌跡多呈直線。模型組環(huán)繞池壁航行16～28次而幾乎沒有在水池中尋找平臺的傾向，游動方式以邊緣式和隨機(jī)式為主。各組逃避潛伏期隨訓(xùn)練次數(shù)的增多而逐漸縮短。對照組隱匿平臺逃避潛伏期明顯短于模型組(P＜0.01)。見表2。

表1 兩組后足重復(fù)間距和平衡木通過時(shí)間比較

2.3 形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 大體觀察：對照組腦組織雙側(cè)對稱，飽滿(圖1A)；模型組損傷一側(cè)腦組織萎縮，體積變小(圖1B)。HE染色：對照組腦室旁細(xì)胞形態(tài)正常，排列規(guī)則(圖1C)；模型組一側(cè)腦室旁正常組織結(jié)構(gòu)破壞，可見散在的不規(guī)則囊腔，周圍細(xì)胞腫脹、變性、排列紊亂，并可見大小不等圓形軟化灶，細(xì)胞數(shù)量較對側(cè)少，神經(jīng)細(xì)胞明顯減少，神經(jīng)細(xì)胞變性壞死，膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生(圖1D)。

表2 出生后4周M orris水迷宮測試小鼠逃避潛伏期(s)

圖1 實(shí)驗(yàn)動物出生4周時(shí)腦室旁組織大體觀察和病理觀察

3 討論

動物模型的制備是研究疾病發(fā)生發(fā)展及探索其防治方法最基本最重要的步驟。目前腦癱動物模型評價(jià)的研究主要以行為學(xué)和形態(tài)學(xué)為主，缺乏認(rèn)知功能方面的評價(jià)。

智力損傷是腦癱的主要并發(fā)癥之一，在注意力、記憶力及空間思維方面的損傷尤為顯著[9]。我們在前期研究[10]的基礎(chǔ)上，評價(jià)新生幼鼠缺血缺氧動物模型的認(rèn)知功能情況。

神經(jīng)行為學(xué)檢驗(yàn)顯示：與對照組比較，模型組后肢足印步態(tài)重復(fù)性差，表現(xiàn)為后足重復(fù)間距增大，且間距不穩(wěn)定；平衡木通過時(shí)間延長，存在運(yùn)動障礙。

M orris水迷宮實(shí)驗(yàn)是一種評價(jià)空間學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典方法，被廣泛應(yīng)用于認(rèn)知功能的檢測[11-15]。本實(shí)驗(yàn)顯示，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，模型組與對照組比較，逃避潛伏期明顯延長。提示實(shí)驗(yàn)鼠學(xué)習(xí)記憶功能下降，空間記憶能力明顯受損。

人類新生兒及圍產(chǎn)期腦損傷后特征性的病理表現(xiàn)為腦室周圍白質(zhì)彌漫性或局灶性軟化灶，殘留大片完整的灰質(zhì)[16-19]。本組病理觀察符合腦室周圍白質(zhì)局灶性軟化，與人類新生兒圍產(chǎn)期腦損傷形態(tài)學(xué)改變相似。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用單側(cè)頸總動脈結(jié)扎并離斷，合并環(huán)境缺氧的方法制作幼鼠腦損傷模型，行為學(xué)、認(rèn)知功能及組織病理方面符合新生兒缺血缺氧性腦病的特征，為研究提供了理想的動物模型。

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Newborn Hypoxic-ischem ic Brain Dam age M odeling in Rats

CHEN Gang,WANG Wei-zhe,CHEN M ing-zhao,et al.Department of Neurosurgery,the Fourth Affiliated HospitalofSoochow University,Wuxi214026,Jiangsu,China

Ob jectiveTomodel the newborn hypoxic-ischem ic brain damage in rats.M ethods25 7-day-old healthy W istar ratswere divided into control group(n=12)and model group(n=13).2 h after ligating andmutilating the unilateral common carotid arteries,the rats in themodel group were put into an airtighted box w ith the volume fraction of 8%oxygen and 92%nitrogen for 2 h.4 weeks after operation, all the rats were assessed behaviorally and pathologically.Resu ltsThe footprint repeat space of rats were larger and more instable in the model group than in the control group(P＜0.05).The time the rats crossing the balance beam w as longer in themodel group than in the control group(P＜0.05).The escape latency of the watermaze testwas longer in themodel group than in the control group(P＜0.05).The right brain became smaller than the contralateral.HE staining showed that the cells around impaired periventricle were swelling,and cell number was less than the contralateral.The neurons decreased,some degenerated and necrosisneurocytesappeared in the impaired side.ConclusionThemodelof hypoxic-ischem ic brain damage hasbeen established.

hypoxic-ischem ic brain damage;animalmodel;neuroethology;w atermaze test;pathology;rats

R742

A

1006-9771(2012)07-0612-03

2012-02-27

2012-05-28)

1.國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30960393)；2.新疆維吾爾自治區(qū)“十一五”科技攻關(guān)和重點(diǎn)科技項(xiàng)目(No.200633128(2))。

1.無錫市第四人民醫(yī)院，蘇州大學(xué)附屬第四人民醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇無錫市214062；2.新疆維吾爾自治區(qū)昌吉市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，新疆昌吉市831100；3.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院，a：神經(jīng)外科；b：病理科，新疆烏魯木齊市830001。作者簡介：陳剛(1970-)，男，重慶市人，博士，副主任醫(yī)師，主要研究方向：中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.07.005