一氧化氮和一氧化氮合酶在大鼠腦損傷組織中的表達(dá)

顱腦損傷患者早期死亡常常取決于原發(fā)性腦損傷及繼發(fā)性損傷的程度。及時(shí)適當(dāng)?shù)闹委?，可以減輕和避免腦損傷后某些繼發(fā)性病理改變，提高療效，改善預(yù)后。Graham等發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷性腦損傷死亡患者的90％有缺血性改變，是繼發(fā)性損傷的主要機(jī)制。近年來(lái)，一氧化氮（nitric oxide，NO）［1］在急性腦缺血損傷中的作用日益受到人們的關(guān)注。NO是目前公認(rèn)的一種信息傳遞分子［2］，在創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）中，具有興奮性氨基酸和產(chǎn)生氧自由基的作用，業(yè)已證明NO參與腦缺血過(guò)程中N－甲基－D天門(mén)冬氨酸（NMDA）調(diào)節(jié)的神經(jīng)毒性和氧自由基損傷［3］。本文旨在研究 TBI后 NO與NOS（nitrie oxide synthase，NOS）在腦組織中的變化及意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 Sprague-Dawley大鼠52只，雌雄不限，體質(zhì)量（300±50）g，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。36只Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（n＝6）和手術(shù)組（n＝30），手術(shù)組按受傷到處死的不同時(shí)間（6、24、72、120、168 h）分成 5 個(gè)亞組，每亞組6只。上述各組行腦組織勻漿NO、NOS檢測(cè)及腦組織含水量測(cè)定。剩余16只，分為4組，正常對(duì)照組4只，傷后6、72、168 h各4只，行組織病理切片檢查。

1.2 顱腦損傷動(dòng)物模型制備 參照 Feeney′s［8］自由落體撞擊傷方法。SD大鼠稱重后經(jīng)2％戊巴比妥鈉50 mg／kg腹腔注射麻醉后，俯臥固定于腦立體定位儀上，頭部剃毛。消毒后于矢狀中線切開(kāi)頭皮，分離骨膜，暴露前囟、冠狀縫及頂骨，以前囟后3 mm，向右旁開(kāi)矢狀縫3 mm為中心作一直徑為4～5 mm顱骨鉆孔。保持硬腦膜不受損傷。將自由落體裝置底座置于右頂骨窗部的硬腦膜表面，以40 g砝碼樣重物自25 cm高沿套管下落打擊致傷底座（直徑 3.6 mm，最大下陷距離 3.2 mm）造成右頂局限性損傷。假手術(shù)組僅作頭皮切口，開(kāi)顱骨窗，不致腦損傷。

1.3 NO含量、NOS活力及腦組織水含量的測(cè)定

預(yù)定時(shí)間予2％戊巴比妥鈉50 mg／kg腹腔注射麻醉以直血管鉗從兩側(cè)眶部穿通，向腹側(cè)彎曲，折斷顱骨，后咬除顱骨，迅速活殺斷頭處死大鼠，快速取腦。在左頂挫裂傷臨近皮層取約250 mg及150 mg腦組織各一份。前者用于腦組織含水量測(cè)定，后者用于NO含量及NOS活力測(cè)定，250 mg左右的腦皮層組織經(jīng)電子分析天平稱重后置入預(yù)稱重的小瓷坩鍋中，恒溫干烤箱110℃烘烤 24 h，烤至恒重（兩次稱重差別≤0.2 mg），按Elliott公式計(jì)算腦組織水含量：腦含水量（％）＝（濕重－干重）／濕重 ×100％。4只空瓷坩堝經(jīng)同樣干燥方法，稱取質(zhì)量計(jì)算稱樣修正誤差。150 mg腦組織標(biāo)本均置于－20℃低溫冰箱中待生化測(cè)定。

1.4 組織病理學(xué)檢查 動(dòng)物予以深度麻醉后開(kāi)胸，以100 mL冷生理鹽水經(jīng)左心室主動(dòng)脈灌注沖洗，然后以含4％多聚甲醛的0.1 mol／L PB液（pH 7.2）灌注固定，取腦。同液中固定4 h后置入含20％的蔗糖的0.1 mol／L PB液中4℃過(guò)夜。待組織下沉后取出，恒冷冰凍切片機(jī)做冠狀切片，切片自損傷前緣起，至后緣結(jié)束，片厚40 μm。冰凍切片行NADPHd組化染色。NADPHd組化染色步驟如下：切片收集于 0.01 mol／L PBS（pH 7.2～7.4）在中，經(jīng)PBS漂洗3次，然后將切片置于NADPHd底物反應(yīng)液中37℃孵育45 min。反應(yīng)液為含 0.3％TritonX-100、0.2 mg／mL 硝基四氮唑藍(lán)（NBT）和 β-NADPHd（購(gòu)自 Boehinger Mannheim 公司）的 0.01 mol／L PBS（pH 7.2－7.4）。反應(yīng)后將切片移入 0.01 mol／L PBS漂洗。常規(guī)裱片、脫水、透明、中性樹(shù)脂封片。切片采用Olympus光學(xué)顯微鏡觀察，做進(jìn)一步定性分析。強(qiáng)反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞：胞漿著色濃密，呈藍(lán)黑色；相應(yīng)核空白區(qū)變小，甚至消失；該類陽(yáng)性細(xì)胞突起亦呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)。中等強(qiáng)度反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞：胞漿含藍(lán)色顆粒，顆粒不聚集成團(tuán)塊；核空白區(qū)存在，為正常大??；細(xì)胞突起著色稍淡。弱反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞：胞漿稀疏散在細(xì)小藍(lán)色顆粒；核空白區(qū)明顯，為正常大??；未見(jiàn)突起著色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料數(shù)據(jù)用x±s表示，采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，組間兩兩比較采用g檢驗(yàn)。檢測(cè)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 TBI后腦組織NO含量、NOS活力變化 見(jiàn)表1。由表1顯示TBI后腦組織中NO含量、NOS活力在傷后6 h即有升高，72 h明顯升高，后雖有下降，但一直處于較高水平。對(duì)表1數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析顯示各組NO含量與對(duì)照組比較有明顯差異（F ＝468.89，P＜0.05），組間比較顯示，各組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)對(duì)表數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析顯示各組NOS活力與對(duì)照組比較有明顯差異（F ＝84.32，P＜0.05），組間比較顯示，各組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 TBI后腦組織含水量變化 表1顯示TBI后腦組織含水量在傷后6 h即有升高，72 h明顯升高，后雖有下降，但一直處于較高水平。對(duì)表1數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析顯示各組腦組織含水量與對(duì)照組比較均有明顯差異（F ＝1963.51，P＜0.05），組間比較顯示，各組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 皮層及腦底NOS陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)纖維的變化 在TBI后腦內(nèi)NADPHd染色NOS陽(yáng)性細(xì)胞展示不同的反應(yīng)強(qiáng)度。在皮層主要可見(jiàn)散在分布的多極強(qiáng)反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元。在陽(yáng)性細(xì)胞周?chē)謩e見(jiàn)到數(shù)量不等的NADPHd陽(yáng)性反應(yīng)纖維，追蹤來(lái)源，觀察到除少量陽(yáng)性纖維起源于強(qiáng)反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞外，大部分纖維未見(jiàn)連于陽(yáng)性細(xì)胞的胞體。損傷組6 h后傷灶部位NOS細(xì)胞明顯增多，主要是一些中等強(qiáng)度反應(yīng)細(xì)胞，腦底出現(xiàn)了強(qiáng)反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元，并有濃染粗大的NOS纖維束，病變持續(xù)，在168 h有所減弱，正常對(duì)照組中NOS陽(yáng)性細(xì)胞及陽(yáng)性纖維顯著少于其他各組（1－8圖中均為NADPHd組化染色 ×25）。

表1 腦損傷后腦組織NO含量、NOS活力、腦組織含水量的變化

圖2 正常大鼠腦底少量NOS弱陽(yáng)性反應(yīng)神經(jīng)細(xì)胞

圖3 大鼠TBI 6 h后皮層較多NOS強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)神經(jīng)細(xì)胞，陽(yáng)性神經(jīng)纖維束

圖4 大鼠TBI 6 h后腦底較多濃染NOS強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)神經(jīng)細(xì)胞群、染色塊及陽(yáng)性纖維束

圖5 大鼠TBI后72 h皮層較多NOS強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)神經(jīng)細(xì)胞及陽(yáng)性纖維束

圖6 大鼠TBI后72 h腦底較多NOS強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)神經(jīng)細(xì)胞群、染色塊及成束的陽(yáng)性纖維

圖7 大鼠TBI 168 h皮層NOS中等程度陽(yáng)性反應(yīng)神經(jīng)細(xì)胞及陽(yáng)性纖維

圖8 大鼠TBI 168 h后腦底NOS強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)神經(jīng)細(xì)胞、染色塊及陽(yáng)性纖維束

3 討論

由于NO化學(xué)性質(zhì)活潑，因而其合成酶一氧化氮合成酶，成為近年研究的熱點(diǎn)。生物體內(nèi)NO是由左旋精氨酸（L-argininine，L-Ary）在 NOS的作用下合成。NO以相對(duì)特異的方式參與多種細(xì)胞及組織的生理病理過(guò)程，是一種相對(duì)穩(wěn)定的通過(guò)細(xì)胞膜擴(kuò)散的氣體自由基，具有抑制血小板聚集（PA）、抑制血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）、抑制血小板激活因子（PAF）、誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞－內(nèi)皮細(xì)胞相互作用、調(diào)節(jié)血管張力、穩(wěn)定循環(huán)容積、介導(dǎo)細(xì)胞免疫和細(xì)胞毒等作用［5］。NO在NOS的催化下合成，其半衰期很短，NO的量與NOS的表達(dá)有直接關(guān)聯(lián)，所以研究腦損傷腦缺血后NOS變化是間接了解NO變化的方法之一［6］。NO非經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞功能調(diào)節(jié)因子或信使，其在神經(jīng)系統(tǒng)正常功能和疾病中，特別是在腦缺血中的作用日益受到重視。大腦某局部血流一旦中斷，就會(huì)因氧和能量供應(yīng)停止而產(chǎn)生局灶性損傷。腦缺血時(shí)神經(jīng)末梢釋放大量的谷氨酸，刺激NMDA受體引起Ca2＋內(nèi)流，使細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度升高，達(dá)到一定濃度時(shí)，激活NOS活性，促進(jìn)NO的產(chǎn)生，表現(xiàn)在腦缺血5～10 min，NO 突然升高，30 min 時(shí)達(dá)高峰。Tominage［7］等證實(shí)，再灌注時(shí)或腦缺血后期NO再度升高。研究資料表明，NO在腦缺血中有雙重作用［3］，腦缺血早期產(chǎn)生的NO可通過(guò)激活鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶使cGMP水平升高，擴(kuò)張腦血管，從而增加缺血區(qū)腦血流，保護(hù)腦組織。即在腦缺血早期表現(xiàn)出保護(hù)作用，但NO濃度持續(xù)性增高可導(dǎo)致DNA和線粒體的功能損害［4，8］，后期表現(xiàn)為神經(jīng)毒性作用［9］。而過(guò)量合成的NO也可通過(guò)超氧自由基反應(yīng)，生成過(guò)氧亞硝酸根離子等造成腦神經(jīng)細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，ATP酶活性降低，細(xì)胞蛋白質(zhì)損傷，且能使各種含鐵硫的酶失活，從而阻斷細(xì)胞內(nèi)能量合成及DNA復(fù)制，亦可通過(guò)影響細(xì)胞的線粒體功能實(shí)現(xiàn)其毒性作用。

NOS有3種亞型，即神經(jīng)元型（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）、內(nèi)皮型（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、誘導(dǎo)型（inductional nitric oxide synthase，iNOS）。各型在腦組織中的分布以及在腦缺血中的作用各不相同。一般應(yīng)用NADPHd組織化學(xué)方法研究NOS神經(jīng)元的活性。NADPHd染色陽(yáng)性神經(jīng)元與腦組織內(nèi)含NOS神經(jīng)元分布一致。NADPHd組織化學(xué)方法在對(duì)神經(jīng)元內(nèi)的nNOS神經(jīng)元定位、定性方面具有很強(qiáng)的一致性。即陽(yáng)性神經(jīng)員內(nèi)含nNOS。NADPHd組織化學(xué)方法顯示NOS活性原理是：NOS在激活過(guò)程中首先接受NADPHd傳遞的電子，使酶分子中的黃素腺嘌呤二核苷酸／黃素單核苷酸（FAD／FMN）還原NOS成還原型，在其他氣體如硝基四氮唑藍(lán)被還原成二甲替顆粒，再局部沉積，通過(guò)觀察顆粒顏色深淺可判定NOS的活性。nNOS是鈣離子依賴酶，正常情況下，其活性較低，產(chǎn)生生理量的NO，起到細(xì)胞間信息傳遞作用。腦缺血后，其活性升高。其活性升高機(jī)制如下：大腦缺血后，細(xì)胞能量代謝障礙，細(xì)胞膜上Na＋-K＋-ATP酶活性受抑，細(xì)胞外鉀濃度升高，神經(jīng)元細(xì)胞膜去極化，電壓依賴性鈣離子通道開(kāi)放，細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多。谷氨酸釋放增加，重?cái)z取減少，突觸間隙聚集大量谷氨酸，過(guò)度興奮NMDA受體，其調(diào)控的鈣通道開(kāi)放，細(xì)胞外鈣離子大量?jī)?nèi)流。鈣離子與鈣調(diào)蛋白結(jié)合后使nNOS活性升高［9］，腦缺血后，ATP 產(chǎn)生減少，nNOS去磷酸化，故其活性增加。

本實(shí)驗(yàn)表明：TBI后腦組織及血漿內(nèi)NO含量、NOS活力即有升高，在傷后6 h即有升高，72 h明顯升高，后雖有下降，但在1周內(nèi)處于較高水平。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Tominage［6］等的報(bào)道結(jié)果相吻合。但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1周內(nèi)NO含量、NOS活力持續(xù)升高，說(shuō)明繼發(fā)性腦損害不僅在傷后存在，而且1周內(nèi)持續(xù)存在。分析認(rèn)為可能有以下幾點(diǎn)機(jī)制：①外傷后腦缺血，造成過(guò)度表達(dá)的NOS，引起過(guò)量的NO生成，其中NO含量及NOS活性以72 h較高，在其后雖有下降，但一直高于正常對(duì)照組。②腦水腫的繼發(fā)性改變與持續(xù)存在壓迫腦血管分支導(dǎo)致腦血供下降，使神經(jīng)細(xì)胞供氧量下降，同時(shí)缺氧，神經(jīng)細(xì)胞大量釋放谷氨酸，能激活NOS活性，促使NO含量升高。可以導(dǎo)致自由基的形成，引起細(xì)胞膜通透性升高，加重腦水腫。本實(shí)驗(yàn)證明了在腦組織中NO、NOS與腦水腫的程度變化趨勢(shì)一致。因此腦水腫與NO含量互為因果，提示在TBI后，檢測(cè)NO含量可以判斷腦水腫的程度。同時(shí)說(shuō)明既然TBI后持續(xù)存在NO、NOS升高，那么NOS抑制劑的早期使用是必須的，而且用藥周期至少維持一周。同時(shí)，早期使用甘露醇解除腦水腫，也可以成為防治繼發(fā)性腦損害的重要措施。

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