人類大鼠肉瘤蛋白同源蛋白和高遷移率族蛋白A1在垂體腺瘤中的表達與侵襲性的關(guān)系☆

垂體腺瘤屬顱內(nèi)常見良性腫瘤，但約1／3的腫瘤呈侵襲性發(fā)展，可侵犯海綿竇、蝶竇、下丘腦等周圍組織結(jié)構(gòu)，使得手術(shù)全切除困難，患者術(shù)后常需放射治療、藥物治療等綜合治療。盡管如此，侵襲性垂體腺瘤患者仍有較高的復(fù)發(fā)率。因此，探尋侵襲性垂體腺瘤的發(fā)病機制一直是研究的熱點。近年來，在研究腫瘤侵襲性行為相關(guān)的靶點中發(fā)現(xiàn)：HRAS和HMGA1在細胞內(nèi)信號傳遞和細胞增殖過程中起著關(guān)鍵和核心作用，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，同時可作為判斷腫瘤侵襲性程度的可靠生物學(xué)指標［1，2］。因此本研究將以 HRAS 和 HMGA1為研究靶點，檢測二者分別在侵襲性、非侵襲性垂體腺瘤中的表達情況，并探討二者與垂體腺瘤侵襲性行為發(fā)生的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2011年8月至2012年5月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科60例垂體腺瘤患者的術(shù)后組織標本（經(jīng)患者知情同意后進行相關(guān)實驗），其中男25例，女35例，年齡16～72歲，平均年齡45.2歲。侵襲性垂體腺瘤的判斷標準：①本研究采用Wilson改良的Hardy分類法［3］將Ⅲ～Ⅳ級或C、D、E期的腫瘤歸為侵襲性腺瘤；②術(shù)前影像學(xué)改變，CT及MRI可見海綿竇、鞍旁及下丘腦等鄰近結(jié)構(gòu)的破壞；③術(shù)中所取鞍底骨質(zhì)或鄰近硬腦膜經(jīng)病理學(xué)證實有腫瘤細胞侵犯；④術(shù)中見鞍底骨質(zhì)及硬腦膜被侵襲破壞，腫瘤突入蝶竇腔或侵入鞍旁的血管神經(jīng)。符合其中之一者即可確定為侵襲性垂體腺瘤。60例標本中，侵襲性垂體腺瘤病例標本28例，非侵襲性垂體腺瘤病例標本32例。所有病例術(shù)前有完善的影像學(xué)及內(nèi)分泌檢查資料，術(shù)后經(jīng)病理診斷確診。手術(shù)時取所需組織用生理鹽水洗凈積血，一部分置入4％多聚甲醛溶液內(nèi)固定，一部分直接放入凍存管中，剩余一部分放入經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）水處理過的凍存管中，后兩者置入液氮備用。

1.2 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測HRAS和HMGA1 mRNA表達 按Trizol試劑（購于大連寶生物工程公司）說明書步驟提取總RNA，－80℃冰箱保存?zhèn)溆?。提取的RNA含量通過752型紫外分光光度計測定260 nm吸收值，按每OD260相當 40 μg RNA 計算 RNA 的產(chǎn)率，OD260在1.8～2.0視為抽提的RNA純度很高。PCR引物由大連寶生物工程公司設(shè)計并合成。HRAS上游引物序列5-GCGATGACGGAATATAAGG-3，下游引物序列 5-ACTGGTGGATGTCCTCAA-3，產(chǎn)物長度 289 bp；HMGA1上游引物序列5-TCTCTGCTCCTTCACTGT-3，下游引物序列5-CTCCTGCCTTCCTGTAAC-3，產(chǎn)物長度 277 bp；β-actin上游引物序列5-GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3，下游引物序列5-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3，產(chǎn)物長度594 bp；β-actin上游引物序列 5-TGCGTGACATTAAGGAGAA-3，下游引物序列5-AAGGAAGGCT GGAAGAGT-3，產(chǎn)物長度172 bp。RT擴增條件：37℃15 min，85℃5 s；PCR擴增條件： 94℃30 s，54℃ 30 s，72℃ 20 s，循環(huán) 35次，72℃延伸 5 min。產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳分離；紫外燈下拍照，采用Quantity-one圖像分析軟件比較電泳條帶光密度值，獲得HRAS和HMGA1的相對表達量。

1.3 免疫組織化學(xué) SABC法檢測 HRAS和HMGA1蛋白表達 標本經(jīng)4％甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋連續(xù)切片，HE染色和免疫組化染色。微波爐加熱修復(fù)，以3％H2O2溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶，參照SP試劑盒（購置于北京中杉公司）產(chǎn)品說明書依次進行山羊血清封閉，以PBS代替一抗作陰性對照，一抗（HRAS和HMGA1單克隆抗體購置于美國ABCAM公司），4℃過夜，山羊抗兔二抗孵育，鏈霉素親生物素蛋白－過氧化酶孵育等處理。DAB（購置于北京中杉公司）顯色后，經(jīng)蘇木素復(fù)染、鹽酸酒精分化，碳酸鋰返藍，酒精脫水、透明、中性樹膠封片后于顯微鏡下進行觀察。

根據(jù)IRS（immunoreactive score）半定量法計分：①染色深度，無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；②陽性細胞比例：在高倍（400×）鏡下隨機觀察5個視野，每個視野計數(shù)200個細胞，計算各視野中陽性細胞數(shù)的平均百分比，作為該切片的陽性細胞百分比。5％以下為0分，5％～25％為 1分，26％ ～50％為2分，51％～75％為3分，75％以上為4分。兩項計分結(jié)果相加，0分計為（－），1～ 2分計為（＋），3～ 6分計為（＋＋），6 分以上計為（＋＋＋）。

1.4 Western Blot法檢測 HRAS和 HMGA1蛋白表達 提取侵襲性及非侵襲性垂體腺瘤組織標本中的蛋白成分；BCA法測定蛋白濃度，加入樣品緩沖液，置于沸水浴中加熱5 min；制備15％的分離膠和5％濃縮膠；加樣電泳（濃縮膠80 V，30 min；分離膠 120 V，90 min）；電泳后濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上（110 mA，150 min）；5％脫脂牛奶室溫封閉 2 h；5％脫脂牛奶稀釋一抗（1∶500～1∶1000），室溫孵育2～4 h或4℃過夜；5％脫脂牛奶稀釋二抗（1∶2000～ 4000），室溫孵育 1～2 h；TBST 洗膜 3次；顯影、定影。采用Image J分析軟件比較免疫印跡條帶灰度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用PASW Statistics 18行兩獨立樣本 t檢驗、χ2檢驗，檢測水準 α ＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果 HRAS在侵襲性垂體腺瘤中的 mRNA 表達（0.96±0.16），明顯高于其在非侵襲性垂體腺瘤中的表達（0.54±0.15），差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝10.437，P＜0.05），見圖 1；HMGA1在侵襲性垂體腺瘤中的mRNA表達（1.12±0.20），明顯高于其在非侵襲性垂體腺瘤中的表達（0.52±0.19），差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝11.742，P＜0.05），見圖 2。

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果 HRAS陽性表達為垂體腺瘤細胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒，分布于淡藍色細胞核周圍。在侵襲性和非侵襲性垂體腺瘤組織中HRAS的陽性表達率分別為22／28和15／32，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝6.35，P＜0.05）。HMGA1陽性表達可見細胞核內(nèi)棕黃色顆粒，陰性表達者細胞核呈淡藍色。在侵襲性和非侵襲性垂體腺瘤組織中 HMGA1的陽性表達率分別為 20／28和14／32，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝4.66，P＜0.05），見圖 3。

2.3 Western Blot結(jié)果 HRAS在侵襲性、非侵襲性垂體腺瘤組織中免疫印跡條帶灰度值分別是（1.25±0.16）、（0.76±0.10）（t＝14.848，P ＜0.05）；HMGA1在侵襲性、非侵襲性垂體腺瘤組織中免疫印跡條帶灰度值分別是（0.98±0.12）、（0.66±0.09）（t＝11.852，P＜0.05），見圖 4。

3 討論

圖1 RT-PCR檢測HRAS在侵襲性和非侵襲性垂體腺瘤組織中的表達。M：marker；1、2：侵襲性垂體腺瘤；3、4：非侵襲性垂體腺瘤

圖2 RT-PCR檢測HMGA1在侵襲性和非侵襲性垂體腺瘤組織中的表達。M：marker，1、2：侵襲性垂體腺瘤，3、4、5：非侵襲性垂體腺瘤

HRAS是RAS家族主要成員之一，它在細胞增殖、分化、凋亡等基本生理功能中起著重要作用。作為一個常見的癌基因，它參與了眾多腫瘤的發(fā)生。Yong［1］等對HRAS的分子結(jié)構(gòu)功能進行研究發(fā)現(xiàn)，由166位至189位的氨基酸組成的高變區(qū)（HRV區(qū)），是引起人乳腺細胞侵襲性生長與發(fā)生遷移的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。而位于HRV區(qū)C-端的第173位和174位脯氨酸殘基，則是促成HRAS激活及促進人乳腺細胞侵襲性生長的關(guān)鍵。HRAS磷酸化激活下游信號分子也是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的常見機制。在HRAS誘導(dǎo)老鼠皮膚癌的模型中發(fā)現(xiàn)，凋亡相關(guān)基因PI3K的催化亞基p110α（由PIK3CA編碼）是RAS發(fā)揮關(guān)鍵作用的一個效應(yīng)子［4］。HRAS誘導(dǎo)腫瘤細胞的侵襲性生長還與激活基質(zhì)金屬蛋白酶家族中MMP-2和MMP-9成員有關(guān)［5－6］?；|(zhì)金屬蛋白酶可通過降解基質(zhì)膠原等結(jié)構(gòu)蛋白成分，溶解破壞基底膜和細胞外基質(zhì)，使腫瘤細胞向周圍組織浸潤。在本課題組前期的研究中發(fā)現(xiàn)MMP-2和MMP-9是促進侵襲性垂體腺瘤發(fā)生的重要原因［7－8］。在本研究中，HRAS在侵襲性、非侵襲性垂體腺瘤中的mRNA表達分別是（0.96±0.16）、（0.54±0.15）（P＜0.05），在組織中陽性表達率分別為22／28和15／32（P＜0.05），免疫印跡條帶灰度值分別是（1.25±0.16）、（0.76±0.10）（P＜0.05）。這些結(jié)果充分說明HRAS在侵襲性垂體腺瘤組織中的表達量顯著高于非侵襲垂體腺瘤組織。根據(jù)目前的研究，我們推測，HRAS表達升高可能引起基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌，從而使垂體腺瘤細胞外基質(zhì)降解，參與其侵襲性行為的發(fā)生。我們先前的研究還發(fā)現(xiàn)自噬基因Beclin-1表達水平降低與垂體腺瘤侵襲性行為的發(fā)生密切相關(guān)，而HRAS能通過直接抑制自噬相關(guān)基因Beclin-1的表達，抑制自噬溶酶體的形成，引起細胞自噬性死亡水平降低，導(dǎo)致腫瘤惡性增殖［9－10］。

圖3 免疫組化檢測HRAS和HMGA1在侵襲性和非侵襲性垂體腺瘤組織中的表達。A：垂體腺瘤組織HE染色（400×）；B：垂體腺瘤組織陰性表達（400×）；C：侵襲性垂體腺瘤中HRAS陽性表達（400×）；D：非侵襲性垂體腺瘤 HRAS陽性表達（400×）；E：侵襲性垂體腺瘤中HMGA1陽性表達（400×）；非侵襲性垂體腺瘤HMGA1陽性表達（400×）

圖4 Western Blot檢測HRAS和HMGA1在侵襲性和非侵襲性垂體腺瘤組織中的表達。1、2為侵襲性垂體腺瘤；3、4為非侵襲性垂體腺瘤

高遷移率蛋白家族（HMG）是結(jié)構(gòu)性轉(zhuǎn)錄因子，作為細胞核內(nèi)非組蛋白，通過腺嘌呤－胸腺嘧啶結(jié)合元件同富含腺嘌呤－胸腺嘧啶的DNA鏈小溝結(jié)合。HMGA1是HMG家族成員之一，可調(diào)控多種基因轉(zhuǎn)錄進而參與腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移［2］。研究發(fā)現(xiàn)，HMGA1抑制可維持上皮的極性和完整性并限制細胞增殖的E－鈣粘蛋白表達，E－鈣粘蛋白表達減少將導(dǎo)致腫瘤細胞間粘附力喪失，從而引起腫瘤發(fā)生侵襲及轉(zhuǎn)移。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HMGA1基因的NIH3T3細胞克隆，細胞生長增殖速度加快，可誘導(dǎo)正常NIH3T3細胞惡性轉(zhuǎn)化［11］。在來源于低分化、轉(zhuǎn)移性的結(jié)腸癌細胞中，敲除HMGA1可明顯抑制腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲、腫瘤細胞的移植瘤形成及體內(nèi)轉(zhuǎn)移［12］。同時，HMGA1是原癌基因HRAS的下游信號分子。Cleynent等［13］將原癌基因Ha-RASLeu61表達載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人胚胎腎HEK293細胞株后，qRT-PCR及Western Blot檢測到二者的表達均明顯升高。應(yīng)用熒光素酶報告基因分析發(fā)現(xiàn)，在HMGA1啟動子區(qū)域有三個與HRAS致癌作用相關(guān)的調(diào)節(jié)區(qū)域，包括兩個近端區(qū)域（PRR1；－78／－24 bp），（PRR2；＋222／＋335 bp）及一個遠端區(qū)域（DRR；－1745／－1161 bp），而將含這些區(qū)域的 pIC（－1745／＋265）載體及 HRAS 共轉(zhuǎn)染到HEK293細胞后，HMGA1啟動子活性增加了15～20倍。在本實驗中，HMGA1在侵襲性、非侵襲性垂體腺瘤中的mRNA 表達分別是 1.12±0.20，0.52± 0.19（P＜0.05），在組織中陽性表達率分別為20／28和14／32（P＜0.05），免疫印跡條帶灰度值分別是 0.98±0.12，0.66±0.09（P＜0.05）。這些結(jié)果提示HMGA1在侵襲性組織中的表達量高于非侵襲性組織。另有研究發(fā)現(xiàn)，高水平表達的HMGA1與低水平表達的microRNA-296與前列腺癌的分級分期呈正相關(guān)，microRNA-296可促進HMGA1的降解及抑制其轉(zhuǎn)錄。給以外源性的microRNA-296可減少其表達水平，從而抑制前列腺癌的增殖及侵襲［14］。在我們前期基因芯片篩選侵襲性及非侵襲性垂體腺瘤差異表達的microRNA基礎(chǔ)上［15］，應(yīng)用microRNA靶基因預(yù)測軟件Tartget Scan預(yù)測可調(diào)控 HMGA1的 microRNA，發(fā)現(xiàn) microRNA-138不僅與垂體腺瘤侵襲性密切相關(guān)而且其機制可能與對HMGA1的負調(diào)控作用相關(guān)，但仍需后續(xù)實驗進一步證實。

綜上所述，本實驗研究結(jié)果提示HRAS、HMGA1的高表達與垂體腺瘤的侵襲性生長密切相關(guān)。本課題組前期已檢測到一些與垂體腺瘤侵襲性行為相關(guān)的靶基因，同時應(yīng)用基因芯片完成了對侵襲性垂體腺瘤及非侵襲性垂體腺瘤中microRNA表達差異譜的篩選。在后期的實驗中，我們將從分子水平更深入研究microRNA對前期研究的靶基因的調(diào)控與垂體腺瘤侵襲性的關(guān)系，以期探討促進侵襲性垂體腺瘤發(fā)生的分子信號的相互作用機制，期待為垂體腺瘤找到有效的干預(yù)治療靶點。

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