切除卵巢對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶和海馬雌激素受體α的影響及電針的干預(yù)作用

雌激素對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有重要的保護(hù)作用，雌激素缺乏可造成認(rèn)知功能障［1］。絕經(jīng)后婦女用雌激素替代治療可提高絕經(jīng)后婦女的認(rèn)知和記憶能力［2］。但是有報(bào)道稱絕經(jīng)后婦女長(zhǎng)期使用雌激素替代治療有提高乳腺癌和子宮癌發(fā)病率的危險(xiǎn)［3］。在臨床上，電針對(duì)治療老年婦女認(rèn)知功能障礙有一定的療效［4］，但其作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用卵巢切除大鼠模型，造成認(rèn)知功能障礙，觀察電針對(duì)去卵巢大鼠空間學(xué)習(xí)記憶及敏感腦區(qū)－海馬［5］雌激素受體 α（estrogen receptor alpha，ERα）表達(dá)的影響，探討電針改善絕經(jīng)后婦女認(rèn)知功能的機(jī)制，以期為臨床相關(guān)疾病的治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雌性SD大鼠40只，3月齡，體重160 g～200 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，合格證號(hào)：SCXK（瀘）2007－0005。采用隨機(jī)數(shù)字法將大鼠隨機(jī)分成4組，每組10只：①電針組；②假電針組；③模型組；④假手術(shù)組。

1.2 認(rèn)知功能障礙模型制備 所有大鼠均行10％水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3 mL／100 g）。假手術(shù)組切除卵巢周圍脂肪，其余各組均實(shí)行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。①組切除卵巢2周后予電針刺激，選穴方法按華興邦氏的方法實(shí)施，選取“足三里”“腎俞”兩穴，在不麻醉的狀態(tài)下采用一次性細(xì)美容針刺入穴位，雙側(cè)足三里穴接通韓氏電針儀，刺激參數(shù)：連續(xù)脈沖波，頻率3 Hz～4 Hz，強(qiáng)度4 mA～5 mA，以使大鼠后肢抖動(dòng)為宜，在上午9時(shí)開(kāi)始，每次20 min，隔日 1次，連續(xù)治療 3個(gè)月；②組針刺操作同①組，但不接通電針儀；③④組術(shù)后不予任何處理。

1.3 大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試 各組在上述處理完成后進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試。首先進(jìn)行定位航行試驗(yàn)：歷時(shí)4 d，每天上下午各2次，結(jié)果取4 d的平均值，將大鼠面向池壁，分別從4個(gè)入水點(diǎn)放入池中，記錄大鼠尋找到并爬上平臺(tái)所需時(shí)間即為逃避潛伏期時(shí)間，并記錄4 d的平均游泳距離和游泳速度。定位航行試驗(yàn)后去除平臺(tái)行空間探索試驗(yàn)：將大鼠任選一個(gè)入水點(diǎn)將大鼠放入池中，測(cè)定其在120 s內(nèi)跨越平臺(tái)位置的次數(shù)。

1.4 大鼠海馬ERα表達(dá)水平的檢測(cè) 水迷宮測(cè)試后1周將大鼠用10％水合氯醛（0.3 mL／100 g）麻醉，頸總動(dòng)脈取血，分離血清，－80℃低溫冰箱保存。在冰面上斷頭取腦，并迅速分離海馬組織，立即將海馬組織置液氮中，于－80℃低溫冰箱保存，待用于組織蛋白和mRNA的提取。

1.4.1 大鼠血清雌二醇（estradiol，E2）濃度的檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），最后統(tǒng)一檢測(cè)血清E2水平。空白孔加標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，其余相應(yīng)孔中加標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品（100 μL／孔），36℃孵箱孵育90 min。空白孔加生物素化抗體稀釋液，其余孔加入生物素化抗體工作液（100 μL／孔），36℃孵箱孵育60 min。空白孔加酶結(jié)合物稀釋液，其余孔加入酶結(jié)合物工作液（100 μL／孔），36℃孵箱孵育 30 min。加入顯色底物 100 μL／孔，36℃孵箱孵育 15 min。加入終止液100 μL／孔，混勻后即刻測(cè)量450 nmOD值。

1.4.2 大鼠海馬 ERα蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用免疫印跡法（Western blot，WB）檢測(cè)，組織充分裂解，離心，分裝。配置蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，測(cè)定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠，按恒流200 mA通電，電轉(zhuǎn)移100 min。加入封閉液和適量一抗抗體ERa（1∶400 Santa Cruz），搖床搖蕩孵育（4℃，過(guò)夜）。PBST漂洗濾膜，將膜與HRP結(jié)合的二抗（辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記抗體）用封閉液稀釋（1∶5000）室溫下?lián)u蕩孵育2 h，然后用PBST充分洗膜。曝光、顯影、洗像。對(duì)各特異性蛋白條帶與相應(yīng)的內(nèi)參條帶進(jìn)行灰度掃描，以兩者比值作為該蛋白合成的相對(duì)量。

表1 各組大鼠Morris水迷宮測(cè)試成績(jī)比較（±s，n＝10）

表1 各組大鼠Morris水迷宮測(cè)試成績(jī)比較（±s，n＝10）

注：1）與假電針組比較，經(jīng)單因素方差分析P＜0.012）與模型組比較，經(jīng)單因素方差分析P＜0.013）與假手術(shù)組比較，經(jīng)單因素方差分析，P＜0.01

組別電針組假電針組模型組假手術(shù)組逃避潛伏期（s）18.02±4.791）2）33.61±5.622）3）42.95±4.053）18.08±4.28游泳距離（cm）361.25±35.871）2）693.22±42.552）3）930.15±38.613）395.75±30.26游泳速度（cm／s）20.55±3.24 19.97±2.69 19.85±3.52 21.79±3.44跨越平臺(tái)數(shù)（t）8.53±0.831）2）3.64±0.882）3）2.35±0.443）8.94±0.91

1.4.3 大鼠海馬ERαmRNA表達(dá)的檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）檢測(cè)。取100mg海馬組織，用 Trizol法（Invitrogen Life Technologies）提取海馬組織總RNA，紫外分析及電泳檢測(cè)總RNA的純度、濃度及完整性。逆轉(zhuǎn)錄按ReverTra Ace-α-逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO）操作步驟進(jìn)行。引物設(shè)計(jì)：由Invitrogen Biotechnology Co，LTD中國(guó)公司合成。ERa 上 游 引 物 ：5′-GTTTGCTCCTAACTTGCTCT TGG-3′，ERa下游引物 ：5′-CGGTGGATGTGGTCCTTCTCT-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度222 bp；內(nèi)參β-actin上游引物：5′-CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3′，內(nèi)參 β-actin 下游引物：5′-TA GGAGCCAGGGCA GTAATCT-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度110 bp。實(shí)時(shí)定量RTPCR反應(yīng)按THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix試劑盒（TOYOBO）操作步驟進(jìn)行，結(jié)果處理采用 ΔΔCT法。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮法行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果 與模型組比較，電針組和假電針組逃避潛伏期和游泳距離均明顯縮短（F ＝64.734，P＜0.01；F ＝563.857，P＜0.01），跨越平臺(tái)次數(shù)明顯增加（F ＝181.451，P＜0.01），且電針組改變更為明顯，與假手術(shù)組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。各組大鼠游泳速度無(wú)顯著性差異（F ＝0.122，P＞0.05）。見(jiàn)表 1。

2.2 電針對(duì)去卵巢大鼠血清E2，海馬區(qū)ERa蛋白和mRNA表達(dá)的影響 與模型組比較，電針組和假電針組大鼠血清E2水平顯著升高（F＝30.13，P＜0.01），但電針組升高更明顯。電針組ERa蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著上升（F＝29.80，P＜0.01；F ＝96.19，P＜0.01），假電針組雖ERa蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)量較模型組有所上升，但仍與假手術(shù)組、電針組之間有差異（P＜0.01）。見(jiàn)圖 1、2，表 2。

圖1 各組大鼠海馬ERa蛋白表達(dá)

表2 各組大鼠血清E2濃度，海馬區(qū)ERa蛋白和mRNA表達(dá)比較（± s，n＝10）

表2 各組大鼠血清E2濃度，海馬區(qū)ERa蛋白和mRNA表達(dá)比較（± s，n＝10）

注：1）與假手術(shù)組比較，經(jīng)單因素方差分析，P＜0.012）與模型組比較，經(jīng)單因素方差分析，P＜0.013）與假電針組比較，經(jīng)單因素方差分析，P＜0.01

組別電針組假電針組模型組假手術(shù)組ERa mRNA相對(duì)表達(dá)量1.410±0.0621）2）3）1.153±0.0351）1.037±1.0211）2.303±0.065血清E2濃度（pg／mL）56.47±6.701）2）3）49.29±5.901）2）38.16±5.441）65.13±7.72 ERa蛋白相對(duì)表達(dá)量0.796±0.0721）2）3）0.498±0.0631）0.406±0.0401）0.985±0.086

圖2 A：內(nèi)參基因β-actin擴(kuò)增曲線；B：內(nèi)參基因β-actin溶解曲線；C：目的基因ERa擴(kuò)增曲線；D：目的基因ERa溶解曲線。

3 討論

切除卵巢是一種較好的制備雌激素缺乏模型方法［6］。去卵巢大鼠模型不僅有類似絕經(jīng)婦女雌激素水平的變化，而且出現(xiàn)相應(yīng)的學(xué)習(xí)記憶功能障礙，是一種較好的研究絕經(jīng)后中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變的模型，已被廣泛用于觀察體內(nèi)雌激素減少對(duì)機(jī)體認(rèn)知功能活動(dòng)影響的實(shí)驗(yàn)中［7］。故本實(shí)驗(yàn)采用去卵巢大鼠動(dòng)物模型，造成認(rèn)知功能障礙。陳士鐸《辯證錄》中立有“呆病門”，分析其主要病機(jī)在于肝郁乘脾，胃衰痰生，積于胸中，彌漫心竅，使神明受累，髓減腦消而病。因此提出本病治療以健脾逐痰、健胃通氣為主要方法。“足三里”屬足陽(yáng)明胃經(jīng)，且為胃的下合穴，針之能健脾和胃，化痰理氣?！澳X為髓?！保I藏精而生髓充腦，腦與腎關(guān)系最為密切，故選用腎的背俞穴“腎俞”補(bǔ)腎益髓，填精養(yǎng)神。

雌激素在特定腦區(qū)作用于學(xué)習(xí)或記憶，海馬結(jié)構(gòu)是一個(gè)對(duì)多種刺激較為敏感的區(qū)域，同時(shí)還含有豐富的雌激素受體［8］。因此本試驗(yàn)檢測(cè)ERa蛋白和基因表達(dá)的區(qū)域定位于對(duì)學(xué)習(xí)記憶關(guān)系最為密切的腦區(qū)—海馬。有報(bào)道稱雌激素下降使老年大鼠海馬樹(shù)突棘生長(zhǎng)降低，這種下降與海馬突觸部位ERa丟失相關(guān)［9］。這激發(fā)了人們的猜測(cè)：ERa是雌激素調(diào)節(jié)老年大鼠海馬突觸發(fā)生的基礎(chǔ)，ERa是長(zhǎng)期影響海馬突觸發(fā)生的主要受體。這些研究對(duì)在大腦發(fā)育中ERa表達(dá)的重要性提供了深遠(yuǎn)的影響，同時(shí)對(duì)海馬發(fā)育中ERa表達(dá)對(duì)記憶、學(xué)習(xí)和激素調(diào)節(jié)的神經(jīng)退化性疾病的影響具體重要的意義。

針刺治療認(rèn)知功能障礙的Meta分析表明：國(guó)內(nèi)針刺研究大部分未設(shè)立安慰性針刺對(duì)照組進(jìn)行研究，這使試驗(yàn)結(jié)果的客觀性缺乏更有理的說(shuō)服力［10］。國(guó)外對(duì)針刺治療認(rèn)知功能障礙有效性的看法不一致，有系統(tǒng)分析得出的結(jié)論是沒(méi)有足夠的證據(jù)支持針刺的有效性［11］。因此我們?cè)谠囼?yàn)中特別設(shè)計(jì)了假電針組作為安慰性針刺對(duì)照組，從而更為客觀地研究電針對(duì)認(rèn)知功能的影響。

本實(shí)驗(yàn)采用Morris水迷宮測(cè)試、ELISA、Western blot以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法分別檢測(cè)了去卵巢大鼠行為學(xué)、血清E2濃度、ERa蛋白和基因表達(dá)的變化及電針對(duì)其的影響，結(jié)果顯示：Morris水迷宮測(cè)試中，各組大鼠游泳速度沒(méi)有明顯差異，可以排除因個(gè)體差異引起的不同。電針組與假電針組逃避潛伏期和游泳距離較模型組縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增加，且電針組改變更明顯。徐穎［12］等研究表明電針對(duì)記憶障礙大鼠行為學(xué)有改善作用，且電針治療后其逃避潛伏期尚優(yōu)于正常對(duì)照組，本實(shí)驗(yàn)與上述結(jié)果一致。這說(shuō)明從行為學(xué)角度評(píng)價(jià)，電針可改善去卵巢大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，但電針改善認(rèn)知功能障礙的作用機(jī)制尚不清楚，針刺是否具有與雌激素相同的增強(qiáng)記憶的功能？本研究對(duì)此進(jìn)行了探討，研究結(jié)果顯示，電針組大鼠體內(nèi)血清E2水平明顯高于模型組，說(shuō)明電針能夠提高去卵巢大鼠體內(nèi)雌激素水平。田淑君［13］等研究表明電針足三里穴可升高去卵巢大鼠體內(nèi)雌激素水平，本研究與上述研究結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)還觀察到電針組與假電針組大鼠海馬ERa蛋白和mRNA表達(dá)水平與模型組相比亦明顯升高，因假電針也是對(duì)穴位的刺激，故假電針組大鼠的認(rèn)知功能亦有相應(yīng)改善，但電針組改變更明顯，排除了假電針的混雜影響。結(jié)合Morris水迷宮測(cè)試中行為學(xué)研究結(jié)果，提示電針對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶的提高，可能是通過(guò)上調(diào)海馬ERa蛋白和基因表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這與王偉［14］等觀察到的電針刺激足三里穴上調(diào)去卵巢大鼠海馬ERa mRNA表達(dá)的結(jié)果一致。值得注意的是，本實(shí)驗(yàn)還采用Morris水迷宮測(cè)試研究了電針對(duì)去卵巢大鼠行為學(xué)的影響。結(jié)果提示卵巢切除后，電針足三里和腎俞穴能在蛋白和基因水平上調(diào)節(jié)ERa表達(dá)，這可能是針刺改善老年婦女認(rèn)知功能障礙的機(jī)制之一。這些發(fā)現(xiàn)表明ERa確實(shí)參與學(xué)習(xí)記憶的過(guò)程，有助于進(jìn)一步明確ERa在記憶過(guò)程中的作用。本研究也對(duì)癡呆病ERa的異常表達(dá)提供了一些證據(jù)，特別是阿爾茨海默氏病。

本研究表明，電針對(duì)大鼠腦海馬ERa蛋白和基因表達(dá)均有調(diào)整作用。而電針是如何影響海馬ERa的表達(dá)至今仍不明確，這可能和電針使體內(nèi)雌激素的水平升高有關(guān)，也可能和電針對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌的整體調(diào)節(jié)有密切關(guān)系［15］。影響學(xué)習(xí)記憶的因素也不僅僅是ERa，值得關(guān)注的是已有研究者提出海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度表達(dá)可能影響癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能［16］。因此，電針作用于海馬ERa的詳細(xì)機(jī)制以及對(duì)學(xué)習(xí)記憶其它相關(guān)因素的研究是我們進(jìn)一步研究的目標(biāo)。

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