谷氨酰胺對心肌細胞線粒體膜PTP開放干預作用的實驗研究＊

劉鐵民,張玉玲

(1.聊城大學體育學院生化室,2.聊城大學醫(yī)院,山東聊城 252059)

線粒體是心肌細胞損傷時的主要受損部位[1],線粒體膜通透性轉換孔(permeability transition pore,PTP)為位于線粒體內外膜間的多蛋白孔道,是線粒體內外信息交流的中心樞紐[2]。PTP開放是導致線粒體膜通透性轉移和凋亡蛋白釋放、調控細胞死亡的重要結構基礎[3]。研究表明[4],過度訓練可導致線粒體膜PTP的開放,過度訓練狀態(tài)下心肌線粒體鈣代謝的紊亂、自由基生成增加、磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)活性增加等變化皆與PTP開放密切相關。但如何遏制或調節(jié)PTP開放,能否通過外源性物質的補充來調節(jié)PTP的開放,這些問題尚不清楚。本研究通過補充外源性谷氨酰胺(glutamine,G ln)的對比試驗,探討G ln對心肌細胞線粒體膜PTP開放的干預作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

羅丹明 123(Rhodamine123,Rh123)、魚藤酮(Rotenone)、寡霉素(Oligomycin)、魯米諾 (Luminol)(Sigma),SDS(Pharmacia),Tris、TEMED(AMRESCO),其他試劑均為國產(chǎn)分析純。U-2001紫外分光光度儀(HITACHI),F-4500熒光分光光度儀(HITACHI),3K18低溫高速離心機(Sigma)。

1.2 實驗動物

30只健康雄性SD大鼠(180～220g)(中國科學院動物研究所提供),隨機分為對照組(CG組)、過度訓練組(OG組)和補充 G ln+過度訓練組(G OG組)(n=10)。分籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)環(huán)境溫度22℃±3℃,相對溫度60%±15%,自然光照,自由飲食和飲水。G OG組大鼠訓練開始,每天早晨8點每只大鼠灌服G ln溶液1次(G ln溶液濃度為10%,灌服劑量為500mg/kg bw),連續(xù)灌服8周;為排除灌胃對大鼠刺激的影響,CG組、OG組每天灌服等量的生理鹽水1次。

1.3 實驗方法

1.3.1 過度訓練動物模型的建立 CG組動物進行中等強度的跑臺(BCPT-96型)訓練。第1周:每天完成10m/min×10min的跑臺運動;第2周:每天完成10m/min×10min的跑臺運動后,繼續(xù)加速至15 m/min×10min;以后維持這一運動量直至第8周周末。每周訓練5 d,周末休息。OG組與 G OG組動物進行持續(xù)大運動量跑臺(BCPT-96型)訓練8周,包括一般訓練和力竭訓練各4周。動物跑臺坡度為10°,每周訓練5天,周末休息。一般訓練:第1周:每天完成10m/min×10min的跑臺運動;第2周:每天完成10m/min×10min跑后,繼續(xù)加速至15 m/min ×10min;第 3 周:每天進行 10m/min、15 m/min、20m/min各10min的持續(xù)跑臺訓練;第4周:每天分別進行 10m/min、15 m/min、20m/min、25 m/min各10min的持續(xù)運動。力竭性訓練:從第5周起進行遞增負荷跑臺運動,每天以15 m/min、20m/min、25 m/min各10min運動后加速至30m/min、35 m/min各20min運動,并不斷遞增跑速,直至大鼠力竭。力竭標準:連續(xù)予大鼠施加聲、光、機械刺激后,大鼠不能跑動,下跑臺后連續(xù)喘息,暫時無逃避反應。第6、7、8周做與此相同的訓練。訓練中動態(tài)觀察大鼠的精神狀態(tài)和飲食情況,從第5周開始,每天記錄動物的跑距(m),每周末稱量所有參試動物體重。第8周周末,運動后即刻斷頭處死全部動物。

1.3.2 大鼠心肌線粒體的制備 大鼠斷頭處死后,立即取心臟,剪取心室肌,置于預冷的分離介質中(0.125 mol/L sucrose、0.101 mol/L Tris-HCL,pH 7.4),洗去血液,充分剪碎、勻漿,采用差速離心法分離線粒體,即首先以700×g離心7 min,棄沉淀,上清經(jīng)10000×g離心10min,棄上清,用分離介質懸浮沉淀,以同樣高速離心1次,沉淀以分離介質懸浮即制成線粒體懸液,以上操作均在0℃～4℃進行。極譜式氧電極法測定線粒體耗氧速率以確定其純度。蛋白定量采用Bradford法,線粒體用量根據(jù)其蛋白含量決定。

1.3.3 線粒體PTP開放的檢測 (1)紫外分光光度儀檢測參照Sarah等[5]的方法,用分光光度儀檢測在540nm處的線粒體吸光度(A540nm)的變化來測定PTP開放。反應體系:0.12 mol/L surose,10mmol/L Tris-Mops,pH 7.4,5 mmol/L succinate-Tris,1 mmol/L Pi-Tris,10μmol/LEGTA-Tris,2μmol/L rotenone,1 mg/L oligomycin;線粒體用量為0.15 g/L蛋白濃度;反應溫度為25℃恒溫;終體積為2 ml。反應開始,加入線粒體,記錄其在540nm處的初始吸光度值(A0),1 min后加入150μmol/L CaCl2,記錄其在15 min內吸光度的變化(△A)?！鰽值的升高或下降分別代表PTP開放程度的降低和增加。(2)熒光分光光度儀檢測參照 Fontaine等[6]的方法,用熒光分光光度儀檢測線粒體膜電位改變來測定PTP開放,反應體系同上。取 1 mg線粒體,用 0.12μmol/L Rh123培育5 min后,在F-4500熒光分光光度儀上立即檢測體系中Rh123的熒光強度(激發(fā)波長為488 nm,發(fā)射波長為525 nm),記錄為 F 0、1 min后再加入150μmol/L CaCl2,記錄其在15 min內熒光強度的變化(△F)?！鱂值的升高或降低,分別表示PTP開放程度的下降和增加。

1.3.4 心肌線粒體谷胱苷肽(glutathione,GSH)含量的測定采用電化學法,鈷酞箐(COPC)修飾電極及高壓液相色譜聯(lián)用[7]。

1.3.5 心肌線粒體膜磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)活性測定參考文獻[8],用高靈敏度pH計(PX-215型)離子活度計測定消耗鹽酸的量來計算PLA2的活力。

1.3.6 線粒體丙二醛(malondialdehyde,MDA)的測定采用硫代巴比妥酸縮合法,試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.4 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 15.0軟件進行統(tǒng)計學分析,各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示,方差分析比較組間顯著性差異。

2 結果

2.1 心肌線粒體PTP開放的變化

OG組與G OG組相比,線粒體在540nm處的初始吸光度值(A0)顯著下降(P<0.05)。線粒體在15 min內的吸光度變化(△A)與 G OG組比較,OG組顯著降低(P<0.05)。OG組線粒體Rh123的初始熒光強度(F0)與 G OG組比較,顯著增強(P<0.05)。加入150μmol/L CaCl2后,OG組 △F值與 G OG組比較,明顯降低(P<0.05)。G OG組與CG組比較,無顯著差異(表1)。

Tab.1 Changes of the opening of PTP in myocardial mitochondrial membrane(,n=10)

Tab.1 Changes of the opening of PTP in myocardial mitochondrial membrane(,n=10)

A:Absorbance;F:Fluorescence;PTP:Permiability transition pore＊P<0.05vsG OGgroup

Group A0 △A F0 △F C G 108±45 52.40±0.31 361.67±75.38 174.51±46.34 G OG 114±48 51.32±0.26 371.70±75.26 163.44±48.11 O G 65±31＊ 20.89±0.18＊ 535.32±104.80＊ 89.28±29.75＊

2.2 心肌線粒體MDA、GSH含量和PLA2的活性

與G OG組比較,OG組MDA含量明顯升高(P<0.05),線粒體 GSH含量下降,PLA2活性顯著增加(P<0.05)。G OG組與CG組比較,無顯著差異(表2)

Tab.2 Changes of the MDA and GSH contents and PLA2activity in myocardial mitochondrial membrane(,n=10)

Tab.2 Changes of the MDA and GSH contents and PLA2activity in myocardial mitochondrial membrane(,n=10)

MDA:Malondialdehyde;GSH:G lutathione;FLA2:Phospholipase A2＊P<0.05vsG OGgroup

3 討論

谷氨酰胺(glutamine,G ln)是血液中和體內游離氨基酸池中含量最豐富的游離氨基酸,具有維持體內酸堿平衡、保持小腸黏膜上皮的結構和功能、維持組織中抗氧化劑的貯備、增強免疫功能等重要作用。同時,G ln又是組織間作為氨前體的穿梭工具,是蛋白質合成的重要調節(jié)劑及腎臟產(chǎn)氨的重要物質。另外,G ln是一個生糖氨基酸,可以提供碳鏈氧化分解釋放能量。G ln作為體內含量非常豐富的一種氨基酸,尚具有許多重要的生理功能,它能促進胃腸粘膜細胞增生,維持腸道的完整性,而巨噬細胞的吞噬作用、淋巴細胞的增殖以及蛋白質的合成作用,都必需依賴充足的G ln。機體在運動過程中體內產(chǎn)生大量自由基,對膜性結構造成損傷,影響運動能力。谷胱甘肽(glutathione,GSH)是體內的重要保護因子,可以保護巰基酶的活性,可以在谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)催化下,保護生物膜及生物大分子免受氧化損傷。而 G ln可增加 GSH合成而保護細胞膜免受自由基的損害。增加G ln不但能增加細胞膜的穩(wěn)定性,更重要的能增加細胞的GSH含量,減少氧自由基對機體膜性結構的損害。

線粒體膜通透性轉換孔(permeability transition pore,PTP)是位于線粒體內外膜間由多個蛋白組成的復合孔道,目前認為該復合體至少由胞漿的己糖激酶、外膜的外周苯二氮卓受體、電壓依賴性陰離子通道等組成[2]。正常情況下,PTP可逆性的低水平開放可維持線粒體跨膜電位,其作用是傳遞電信號和鈣信號,一旦在多種死亡信號的刺激下,PTP發(fā)生大量持續(xù)開放,則引起線粒體內膜通透性急劇增加,使得一些正常不能通過內膜的物質(分子量<1500D)可以自由透過內膜,從而繼發(fā)線粒體膜去極化、氧自由基(oxygen free radical,OFR)過量生成、基質滲透性腫脹及凋亡效應蛋白釋放等一系列細胞學效應,致使細胞凋亡的發(fā)生[3]。

有關PTP開放的檢測,目前在整體水平采用較多的是分光光度法,通過測定PTP開放所引起的線粒體狀態(tài)的變化來反映PTP的開放。為保證測定結果的可靠性,本研究根據(jù)PTP開放的兩個特征性改變-線粒體膜腫脹與膜電位下降,線粒體腫脹可表現(xiàn)為A540nm值下降,利用紫外和熒光分光光度法兩種方法分別檢測了過度訓練對大鼠心肌線粒體PTP開放的影響。研究結果顯示,OG組與CG組和G OG組比較,線粒體在540nm處的初始吸光度值(A0)顯著下降(P<0.05),表明過度訓練可導致線粒體PTP開放增加,而 G ln對這種變化有明顯干預作用。Ca2+為一種常用的 PTP開放誘導劑,Ca2+誘導后PTP的變化能力反映了線粒體PTP的初始狀態(tài);將心肌細胞線粒體直接置于Ca2+濃度高達150μmol/L的體系中,發(fā)現(xiàn)線粒體在15 min內的吸光度變化(△A)與CG組和 G OG組比較,OG組顯著降低(P<0.01)。PTP開放還可導致線粒體膜電位下降甚至消失。Rh123為正電性熒光染料,正常情況下,線粒體存在內負外正膜電位,Rh123積聚于線粒體內,當PTP開放引起線粒體膜電位消失,儲積在線粒體內的Rh123釋放出來,造成線粒體內熒光強度降低,而測試介質內熒光強度增高。結果顯示OG組線粒體Rh123的初始熒光強度(F0)與CG組和 G OG組比較,顯著增強(P<0.05);加入150μmol/L CaCl2后,OG組△F值與CG組和 G OG組比較,明顯降低(P<0.05)。這些結果皆表明過度訓練可導致線粒體PTP開放增加,而補充外源性的 G ln對PTP開放有顯著的干預作用。

為探討PTP開放和G ln干預作用的可能機制,本研究還觀察了運動后心肌線粒體丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)GSH和磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)等生化指標的變化。結果顯示,運動后OG組與 G OG組和CG組比較,線粒體 GSH含量顯著降低(P<0.05),PLA2活性顯著增加(P<0.05);MDA含量顯著升高(P<0.05)。過度訓練后MDA含量明顯增加,表明訓練后心肌線粒體氧自由基生成和脂質過氧化水平增加了,因為脂質過氧化反應產(chǎn)物MDA含量變化可作為評定自由基生成及膜脂質雙層結構破壞的指標。由此看來,過度訓練后線粒體氧自由基生成增加可能是誘導PTP開放的重要因素之一,因為內源性自由基的存在可以攻擊膜蛋白巰基,致使膜蛋白發(fā)生交聯(lián),導致線粒體膜PTP開放增加[4]。GSH作為細胞中最豐富的非蛋白巰基的來源,維持線粒體內膜巰基基團的還原狀態(tài),線粒體 GSH的含量對線粒體膜PTP開放起著重要的調節(jié)作用。當線粒體 GSH含量處在較高水平時,線粒體PTP處于穩(wěn)定狀態(tài)。當線粒體 GSH含量排空時、線粒體內膜PTP開放增加[7]。巰基氧化作用對增加PTP開放是必需的,但不是唯一的,過度訓練后心肌線粒體活性氧生成增加,活性氧及其脂質過氧化反應的產(chǎn)物MDA也可直接增加PLA2的活性,而PLA2的激活可使PTP開放增加。這是因為PLA2活性增加,可導致膜磷脂的降解加快,其降級產(chǎn)物溶血磷脂、白三烯、前列腺素可促進細胞膜及亞細胞結構降解,增加膜的剛性和對鈣的通透性。本研究結果顯示,過度訓練后大鼠心肌線粒體GSH含量顯著下降和PLA2的活性明顯增加,這可能是導致過度訓練后心肌線粒體膜PTP開放增加的又一誘發(fā)因素。而G ln作為體內含量最豐富的游離氨基酸[9],對細胞膜的穩(wěn)定性具有廣泛的保護作用,它可通過增加GSH合成速度而增加細胞GSH的儲量,這對保護細胞膜免受自由基的損害,遏制PLA2活性增加和Ca2+積聚等方面具有重要意義?？傊?關于PTP開放機制的問題是一個相當復雜的問題,很多問題尚未完全闡明,尚需進一步研究。

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