Avastin-殼聚糖納米粒的制備△

周 楠 黃 瀟 李玉珍 程金偉 蔡季平

目前，各種阻斷血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)通路及其受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)的抗新生血管生成的研究已成為臨床和基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。以VEGF作為治療靶點(diǎn)，應(yīng)用VEGF單克隆抗體貝伐單抗(Bevacizumab，Avastin)抑制新生血管生成［1-2］，是目前治療新生血管性疾病的又一新策略。在各種靶向VEGF/VEGFR的新生血管生成抑制劑中，Avastin(即Bevacizumab)和Lucentis(即ranibizumab)作為新型的抗VEGF人源化的單克隆抗體，主要通過中和VEGF、阻斷其和內(nèi)皮細(xì)胞上的受體結(jié)合而發(fā)揮作用，減少異常血管生成。Avastin是第一個(gè)被美國FDA批準(zhǔn)的通過抑制新生血管生成而發(fā)揮抗癌作用的新藥。

殼聚糖(chitosan，CS)藥物納米控釋系統(tǒng)是可有效控制藥物傳遞和控釋的載體，可提高藥物的穩(wěn)定性，使藥物在局部保持較高濃度，增加藥物的吸收，且可打開上皮、黏膜細(xì)胞間的緊密連接，增強(qiáng)藥物的滲透作用［3］。應(yīng)用于藥物的器官靶向、提高DNA轉(zhuǎn)染率、多肽蛋白類藥物的非注射途徑給藥以及注射給藥的長效制劑研究，尤其在藥物抗腫瘤血管生成的研究中具有非常廣闊的應(yīng)用前景。而且CS、CS衍生物本身具有多種生物學(xué)活性，作為藥物輔料和藥物結(jié)合在一起將具有雙重的治療效果。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與合成了以Avastin為模藥，以CS為載體的納米粒制劑(Avastin-CS-NP)，采用高壓勻化優(yōu)化制備工藝，并對其物理特性、緩釋性能進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 CS(1～100 g·L-1，脫乙酰度大于92%，相對分子質(zhì)量(60～88)×106，上海如吉生物科技公司);Avastin(上海羅氏制藥公司);多聚磷酸鈉(TPP，1～50 g·L-1，上海旭東海普藥業(yè)公司);Micro-BCA蛋白濃度檢測試劑盒(美國 Pierce公司);其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

SHIMADZU UV-2201紫外分光光度儀(日本島津);Nano-S Malvern動態(tài)光散射納米粒徑測試儀(英國馬爾文公司);BECKMAN NVT90低溫超高轉(zhuǎn)速離心機(jī)(美國貝克曼公司);透射電子顯微鏡JEM-2010(日本電子株式會社);JEOL Ltd.透析袋(可濾過相對分子質(zhì)量為10×103，上海醫(yī)藥試劑公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Avastin-CS-NP 的制備 Avastin-CS-NP 制備條件:Avastin濃度為25 g·L-1，CS/TPP質(zhì)量比為3∶1，T 為(20 ±2)℃，pH 5.5。采用離子膠凝法，步驟如下:(1)配制25 g·L-1的Avastin溶液;(2)濾膜法篩選出相對分子質(zhì)量大于80×103的CS;CS經(jīng)1 mol·L-1NaOH純化(1 g CS:10 mL NaOH液，pH 8.0)，徹底洗脫、烘干;(3)取一定量純化后的CS溶解于0.1 mol·L-1稀醋酸中，制得 CS溶液;以蒸餾水溶解多聚磷酸鈉，配制膠聯(lián)劑(TPP)溶液;取適量(1)中配制的藥物溶液分散于制得的CS溶液中，調(diào)整pH=5.5;(4)將配制的TPP溶液，緩慢滴加于含藥物的CS溶液中。輕輕攪拌，室溫反應(yīng)10 min，即得Avastin-CS-NP;(5)將所制得的Avastin-CS-NP放入高壓乳勻機(jī)，在(10～100)×106Pa壓力下進(jìn)行勻化，得到粒徑分布范圍較窄的Avastin-CS-NP。

1.2.2 納米粒粒徑及分布測定 室溫下取適量Avastin-CS-NP混懸液，置Nano-S粒徑測定儀中測定載藥納米粒的粒徑分布及平均粒徑。

1.2.3 觀察納米粒形態(tài) 滴1～2滴Avastin-CS-NP混懸液于銅網(wǎng)上，20 g·L-1磷鎢酸溶液負(fù)染色，室溫晾干，于透射電鏡下觀察納米粒的形態(tài)。

1.2.4 包封率和載藥量的測定

1.2.4.1 MicroBCA 法蛋白濃度檢測及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 (1)配制BCA工作液:分別取A液1.25 mL，B液1.2 mL，C液0.05 mL充分混勻，按A 液:B液:C液=25∶24∶1的比例配制。(2)配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液:取標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA(2 g·L-1)溶液，分別稀釋成以下濃度:0.125 g·L-1、62.5 ×10-3g·L-1、31.25 ×10-3g·L-1、15.625 ×10-3g·L-1、7.812 5 ×10-3g·L-1、3.906 25 ×10-3g·L-1。(3)取 96 孔板，在1-6孔中分別加入100 μL上述濃度的BSA溶液，在第7孔中加入100 μL蒸餾水，設(shè)為對照孔。在1-7孔中分別加入100 μL BCA工作液，充分混勻。(4)將96孔板放入37℃水浴鍋中孵育2 h。設(shè)定630 nm為參比波長，570 nm為測定波長，用酶標(biāo)測定儀測定各孔吸光度(OD)值。(5)測得Avastin上清液OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.2 包封率和載藥量的計(jì)算 取Avastin-CSNP混懸液適量，4℃超速離心45 min(20 000 r·min-1)，小心提取上清液測定紫外吸收度，測得上清液中藥物濃度計(jì)為Cb(g·L-1)，按投藥量計(jì)算藥物的初始濃度，計(jì)為C(g·L-1)，CS空白納米粒的初始濃度計(jì)為M(g·L-1)。包封率計(jì)算公式:EE=(C-Cb)/C×100%;載藥量計(jì)算公式:LC=(CCb)/M×100%。

1.2.5 Avastin-CS-NP的體外釋放實(shí)驗(yàn) 取一定濃度的納米粒子，選擇 pH 7.4的0.1 mol·L-1PBS溶液為釋放介質(zhì)，加入適量Avastin-CS-NP于溶液中使其充分分散，37℃ 130 r·min-1振搖2 d，分別于2 h、4 h、8 h、16 h、32 h、48 h、96 h 取樣1 mL，后續(xù)每天取樣1 mL離心后取上清液測定藥物濃度，補(bǔ)充同體積蒸餾水，進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)，計(jì)算公式如下:累計(jì)釋放率=(第n次取樣濃度×釋放系統(tǒng)總體積+∑n-1次取樣濃度×每次取樣體積)/總藥量。

2 結(jié)果

2.1 Avastin-CS-NP的形態(tài)、粒徑分布 制得的Avastin-CS-NP懸液外觀呈乳白色的半透明乳膠狀液體。透射電鏡下納米粒子呈圓或類圓形，大小較為均勻，無明顯聚集(圖1)。動態(tài)光散射納米粒徑測試儀測納米粒子大小，平均粒徑為88.9 nm，見表1。

Figure 1 Transmission electron microscope showed good distribution of avastin nanoparticles(×20 000) 實(shí)驗(yàn)制得的單分散的納米顆粒，透射電鏡下具有良好的分散形態(tài)(×20 000)

表1 Avastin-CS-NP粒徑大小及分布Table1 Diameter and distribution of Avastin-CSNP

2.2 納米粒的載藥量與包封率 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:設(shè)630 nm為參比波長，在570 nm波長處測定標(biāo)準(zhǔn)品紫外吸收度，代入回歸方程，見圖2。實(shí)驗(yàn)測得Avastin-CS-NP的包封率、載藥量分別為83.4%和10.4%。

2.3 體外釋放曲線 Avastin-CS-NP的累積釋放曲線見圖3。圖3顯示了Avastin-CS-NP中Avastin的體外釋放行為，具有明顯的緩釋性能。載藥納米粒在最初8 h內(nèi)，釋放速度較快，突釋約25.70%，隨后逐漸減緩，為緩慢持續(xù)地釋放，但以不同的速率進(jìn)行，96 h內(nèi)共釋放80% ～90%。

Figure 2 Standard curve of Avastin-CS-NP Avastin-CS-NP標(biāo)準(zhǔn)曲線

Figure 3 Dissolution curve of Avastin-CS-NP Avastin-CS-NP釋放曲線

3 討論

本研究以CS為藥物載體，采用離子膠凝法制備納米粒，該方法具有快速簡便、成本低、可操作性強(qiáng)等特點(diǎn)，為國內(nèi)首次關(guān)于Avastin納米粒的相關(guān)研究報(bào)道。Avastin-CS溶液中加入 TPP后，瞬間形成Avastin-CS-NP。Avastin通過吸附作用載于納米粒子之上。由于蛋白質(zhì)大分子具有復(fù)雜的三維立體結(jié)構(gòu)，在不同的溶液中可折疊或打開，與CS陽離子發(fā)生相互作用后形成復(fù)雜的包裹，分子構(gòu)象、靜電作用及溶解條件都對其有影響。

CS是聚陽離子電解質(zhì)，由于靜電斥力在溶液中形成分散構(gòu)象，大分子蛋白表面的羧基與伸展的CS鏈上的氨基在某些位點(diǎn)上形成H鍵，在pH 5.5的溶液中仍然保持緊密的三維結(jié)構(gòu)和分子內(nèi)部的疏水核心。因此，蛋白質(zhì)分子的吸附作用并不能完全中和CS分子表面的陽性電荷，CS分子表面仍有較多的游離氨基未被結(jié)合。TPP作為交聯(lián)劑，與CS分子及蛋白質(zhì)分子上的游離氨基結(jié)合形成H鍵，發(fā)生分子內(nèi)和分子間膠聯(lián)即生成結(jié)構(gòu)緊密的Avastin-CS-NP。

同時(shí)，CS溶液需要在特定的濃度范圍內(nèi)，與TPP具有一定的質(zhì)量比才能生成納米粒子［4-6］。TPP濃度一定時(shí)，隨著CS濃度增加，成球越來越難，可能是由于CS溶液黏度增大，鏈的纏繞妨礙了CS分子間膠聯(lián)成球;也可能TPP的量相對不足，不能膠聯(lián)成球。CS濃度一定時(shí)，TPP濃度增加，成球越來越容易，TPP濃度增加到一定程度即生成沉淀，大量的CS與TPP膠聯(lián)形成大的顆粒。

3.1 包封率及其影響因素 包封率是衡量納米粒子性能的一個(gè)重要指標(biāo)，與藥物緩釋特性密切相關(guān)。目前國內(nèi)外尚無Avastin-CS-NP的報(bào)道，而我們制備工藝已能達(dá)到83.4%的包封率，結(jié)果較為滿意。

3.1.1 CS相對分子質(zhì)量對包封率的影響 CS鏈在溶液中的分散長度與其相對分子質(zhì)量相關(guān)。CS分子鏈在pH 5.5溶液中由于氨基間的靜電斥力得以充分展開，長的CS鏈可提供更多的反應(yīng)位點(diǎn)，與蛋白質(zhì)分子結(jié)合形成H鍵。此時(shí)，蛋白質(zhì)分子與氨基結(jié)合不存在嚴(yán)重的空間位阻［7］，蛋白質(zhì)復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)在溶液中也并未充分展開，在不同的溶液中膨脹性不同。本研究選用了相對分子質(zhì)量較高的CS為載體，所得包封率較高。

3.1.2 CS的脫乙酰度對包封率的影響 CS鏈上的氨基內(nèi)在反應(yīng)性相同，故CS對蛋白質(zhì)的包裹受其脫乙酰度的影響［7］。我們使用NaOH純化提高CS脫乙酰度，CS陽離子與蛋白質(zhì)多肽鏈(包含陽性、陰性電荷功能簇)相互作用，而蛋白質(zhì)分子的疏水區(qū)在水溶液中則折疊于三維結(jié)構(gòu)內(nèi)部。

3.1.3 CS濃度對包封率的影響 加入的CS濃度高時(shí)，溶液的黏滯性增加，阻止了蛋白質(zhì)分子在CS鏈上的運(yùn)動，是包封率下降的主要因素［8］。

3.1.4 CS/TPP的質(zhì)量比對包封率的影響 CS/TPP質(zhì)量比越大包封率越下降?？赡苡捎诋?dāng)CS濃度一定時(shí)，TPP量增加，溶液pH增高，隨之而來的蛋白質(zhì)分子表面總的負(fù)電荷增多，使得CS分子與蛋白質(zhì)分子間的靜電相互作用增強(qiáng)，吸附力下降［9］。

3.1.5 Avastin的濃度對包封率的影響 蛋白質(zhì)濃度增加，包封率升高。在恒溫下，蛋白質(zhì)的吸附、包裹在靜電相互作用下遵循飽和動力學(xué)［10］。隨濃度增加，蛋白質(zhì)包裹呈現(xiàn)與濃度相關(guān)的線性增加，在高濃度下達(dá)到峰值。故在蛋白質(zhì)飽和濃度下提高蛋白質(zhì)的包封率是有可能的。我們使用25 g·L-1的Avastin溶液獲得較高的包封率。

3.2 影響藥物從納米粒載體中釋放的因素 目前仍沒有一個(gè)可靠的模型來模擬或預(yù)測藥物的釋放行為，且粒子在體外模擬釋放環(huán)境和動物體內(nèi)的釋放環(huán)境有所不同。研究表明，載藥納米粒釋放為初始爆發(fā)釋放，形成突釋，在其后較長的一段時(shí)間以恒定的速率釋放。釋放機(jī)制一般認(rèn)為有三種:蛋白質(zhì)分子從粒子表面解吸;從膨脹的分子基質(zhì)上擴(kuò)散;聚合物降解后釋放。多數(shù)情況下三種機(jī)制同時(shí)發(fā)生或在藥物釋放的不同時(shí)段某一種機(jī)制起主要作用［11］。

突釋是由靠近粒子表面的蛋白質(zhì)分子快速擴(kuò)散引起［11］。納米粒子具有很大的比表面積，突釋時(shí)，吸附的蛋白在接觸釋放介質(zhì)后瞬間溶解，粒子內(nèi)層基質(zhì)中的蛋白也遵循該機(jī)制，一旦粒子發(fā)生膨脹、水解，蛋白質(zhì)分子在水解作用下分離擴(kuò)散，即形成持續(xù)緩慢的釋放。故緩釋中的蛋白質(zhì)分子緊密結(jié)合于粒子結(jié)構(gòu)內(nèi)部，必須通過完全解離才能從膨脹的分子結(jié)構(gòu)上脫離。且CS分子聚合鏈?zhǔn)嵌嘀豀鍵，在蛋白質(zhì)分子釋放前必須打破此H鍵。Avastin的分子鏈要比納米粒子的粒徑長，它很難在短時(shí)間內(nèi)穿過納米粒子的表面或孔隙擴(kuò)散出來。故Avastin的釋放過程實(shí)際是蛋白質(zhì)與CS的解吸過程。

3.2.1 CS相對分子質(zhì)量對釋放的影響 Agnihotri等［12］在關(guān)于CS納米粒子的綜述中指出:相對分子質(zhì)量可能對蛋白質(zhì)和多肽的釋放有影響。相對分子質(zhì)量大的CS制成的粒子粒徑大，對突釋影響較大［7］。本研究中載藥納米粒8 h內(nèi)突釋明顯，約25.70%，后續(xù)的釋放需要 Avastin-CS-NP的膨脹、降解。

3.2.2 載藥量對釋放的影響 本研究所得納米粒子的載藥量為10.4%。藥物在載體中的濃度即載藥量是非常重要的影響因素，釋放速率通常取決于藥物濃度梯度。藥物載藥量高，納米粒子與釋放介質(zhì)的濃度梯度大，擴(kuò)散速度隨之增大。

3.2.3 CS濃度對釋放的影響 CS濃度和Avastin釋放速度之間不成線性關(guān)系。CS濃度增大，溶液黏滯性增強(qiáng)，使得CS分子、蛋白分子在與TPP作用后形成更強(qiáng)的交聯(lián)，結(jié)構(gòu)緊密，粒子膨脹性下降，從而影響了Avastin的釋放。與CS載小牛血清白蛋白的釋放研究結(jié)果相同［10］。

3.2.4 CS脫乙酰度、Avastin濃度對釋放的影響

脫乙酰度對釋放速度是個(gè)重要的影響因素，甚至可能比載藥量的影響更為重要［7］。對于相同相對分子質(zhì)量的CS，高脫乙酰度含有更多的氨基，與三聚磷酸根離子膠聯(lián)形成更緊密的結(jié)構(gòu)，使得納米粒子表面的滲透性降低，從而延緩Avastin的釋放速度。

Avastin濃度高，形成粒子粒徑增大，粒子總表面積增加，吸附的Avastin分子增多，同時(shí)Avastin分子與粒子間的黏合較疏松，釋放增加。相應(yīng)較低的蛋白質(zhì)濃度，Avastin分子更易與CS分子形成H鍵，影響釋放。

3.3 小結(jié) 離子膠凝法制備工藝簡單、可操作性強(qiáng)。CS納米粒子黏附性好、粒徑小，可使活性大分子藥物順利滲透黏膜組織，尤其適合于敏感蛋白質(zhì)大分子的運(yùn)載［3］。CS納米粒子應(yīng)用于生物大分子藥物載體的研究，已引起國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。但以CS為藥物載體包裹Avastin、延長藥物作用時(shí)間、發(fā)揮抗血管生成作用的研究目前尚少。

本實(shí)驗(yàn)采用無毒性的CS為藥物載體材料，以離子膠凝法制得Avastin-CS-NP，外觀形態(tài)較為圓整，呈單分散狀態(tài)，粒徑分布較窄，平均粒徑在100 nm以下。體外釋放實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證藥物在CS納米粒的運(yùn)載下，體外穩(wěn)定性較好，其活性可得到保持。為后續(xù)的臨床藥效學(xué)研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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