結締組織生長因子在2型糖尿病大鼠虹膜中的表達△

王 虹 吉 雷 劉遠光 周萍萍 張 鵬 王冬蘭

隨著糖尿病發(fā)病率的逐年上升，糖尿病眼部并發(fā)癥的發(fā)生率和致盲率也在逐年上升。虹膜紅變即虹膜新生血管(new vascularization of iris，NVI)常繼發(fā)于視網(wǎng)膜的缺血缺氧性疾病，而糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是其發(fā)生的主要原因。研究表明視網(wǎng)膜在缺血缺氧狀態(tài)下，機體分泌產(chǎn)生多種促血管生成因子，其中結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)在DR的視網(wǎng)膜以及微血管周細胞中的表達均顯著上升。CTGF具有促進微血管周細胞程序性死亡，導致血管滲透性增加，促進DR的早期發(fā)展的作用。還有研究表明，CTGF在促進增生性DR的纖維增生和新生血管的形成中起著重要的作用。但其在糖尿病患者虹膜中的表達及其與虹膜病理改變的相關性研究尚未見報道。本實驗通過電鏡和光鏡觀察糖尿病大鼠及正常大鼠虹膜的特征，并比較CTGF在糖尿病大鼠和正常大鼠虹膜組織中表達的變化，探討其相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選取Wistar大鼠40只(佳木斯大學實驗動物中心提供)，體質(zhì)量180～200 g，隨機分成實驗組和對照組。實驗組為2型糖尿病大鼠，對照組為正常大鼠，每組各20只(各40只眼球)。將實驗組及對照組中各15只眼球用酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme linked immunosorbent assay，Elisa)定量分析虹膜中CTGF的含量，另將實驗組及對照組中其余25只眼球的虹膜組織用于光鏡和電鏡觀察(其中光鏡觀察各15只眼球，電鏡觀察各10只眼球)。

1.2 動物處理

1.2.1 實驗組 實驗組大鼠給予35 mg·kg－1STZ(溶于枸櫞酸緩沖液中，pH 7.2)腹腔注射1次，48 h后測空腹血糖，大于 11.1 mmol·L－1納入實驗組［1］。若小于11.1 mmol·L－1，則按照 5 ～10 mg·kg－1再進行腹腔注射1～2次，48～72 h后再次測定大鼠空腹血糖，若大于11.1 mmol·L－1則納入實驗組。

1.2.2 對照組 對照組大鼠給予同體積的緩沖液腹腔注射。

1.2.3 大鼠的飼養(yǎng) 所有動物自由進水，自然照明，實驗組大鼠給予高脂、高熱量飲食;對照組給予正常飲食，最長飼養(yǎng)90 d。定期觀察大鼠的神態(tài)、體質(zhì)量、尿量、飲食及眼部變化，特別是眼部虹膜的表現(xiàn)。實驗組大鼠一經(jīng)發(fā)現(xiàn)NVI形成(虹膜上出現(xiàn)一些細小彎曲、不規(guī)則的新生血管，多位于瞳孔緣)就立即處死。

1.3 鏡下觀察和Elisa檢測

1.3.1 鏡下觀察 造模成功后處死大鼠取出虹膜組織，分別用甲醛和戊二醛固定、脫水、浸蠟、包埋、組織切片、染色后常規(guī)顯微鏡和透射電鏡下觀察虹膜組織的新生血管形態(tài)改變。對照組標本采集同實驗組。

1.3.2 兩組大鼠虹膜組織中CTGF含量檢測 造模成功后取出兩組大鼠的虹膜組織。將取出的虹膜組織碾碎后，以1200 r·min－1的速度離心取上清。用Elisa定量分析實驗組和對照組大鼠虹膜中CTGF的含量。本實驗應用雙抗體夾心法測定標本中大鼠CTGF水平。按照上海麗臣生物有限公司所提供試劑盒內(nèi)說明書進行檢測。用純化的大鼠CTGF抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入CTGF，再與辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)標記的CTGF抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺顯色。3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的CTGF含量呈正相關。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標準曲線計算樣品中大鼠CTGF濃度。

1.4 統(tǒng)計學分析 實驗中所得計量資料數(shù)據(jù)結果均以均數(shù)±標準差表示，兩組之間的比較用t檢驗，使用SPSS for Windows 16.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠虹膜中CTGF含量的比較 用Elisa定量分析實驗組和對照組大鼠虹膜中CTGF的含量，結果見表1。

表1 實驗組和對照組大鼠虹膜中CTGF的表達Table1 Expression of CTGF in iris of rats in the experimental and control groups(±s，ρ/ng·L－1)

表1 實驗組和對照組大鼠虹膜中CTGF的表達Table1 Expression of CTGF in iris of rats in the experimental and control groups(±s，ρ/ng·L－1)

Note:Compared with control group，*P ＜0.001

Group n CTGF Experimental 15 1010.49 ±8.18*Control 15 644.82 ±8.08

2.2 光鏡和電鏡下兩組大鼠虹膜的特征

2.2.1 光鏡下觀察 對照組切片中未見NVI，大部分切片均未見血管芽;而實驗組大鼠虹膜切片中均可見NVI。實驗組中可見纖維血管膜和血管膜出現(xiàn)，纖維血管膜是由少量的血管和較厚的膠原纖維組織組成(圖1)，該膜表面可見成纖維細胞、巨噬細胞等。血管膜主要是腔大壁薄的毛細血管(圖2)，其周圍可見極少量成纖維細胞和巨噬細胞。

2.2.2 電鏡下觀察 電鏡下觀察對照組大鼠虹膜組織，未見NVI，而實驗組大鼠虹膜組織中可見明顯的NVI形成。實驗組中可見纖維血管膜和血管膜。其中纖維血管膜的血管內(nèi)皮細胞呈特殊性排列(圖3)，即血管內(nèi)外側壁薄厚不對稱，主要表現(xiàn)在面向前房的血管外側壁為內(nèi)皮細胞的菲薄有孔的胞質(zhì)突部分，而內(nèi)側壁多為內(nèi)皮細胞有核部分，壁厚無孔。內(nèi)皮細胞的胞核有明顯的凹陷或為桿狀核，胞質(zhì)中存在少量線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，多見小泡，并有少量致密小體，偶見大的囊泡?；撞堪簧?，基膜為單層，但在無周細胞處可增生達3～4層。周細胞明顯可見，胞質(zhì)清亮，腫脹變性，散在少數(shù)線粒體和小泡，細絲豐富，局部可有空化區(qū)，周細胞基膜增殖顯著，可達5～6層之多。纖維血管膜表面存在的細胞分別具有角膜內(nèi)皮細胞、巨噬細胞的超微結構特征。血管膜的血管內(nèi)皮細胞呈扁平梭狀(圖4)，細胞核呈橢圓形，胞質(zhì)豐富，高爾基體發(fā)達，有中等量線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，小泡較多。內(nèi)皮細胞腔面有較多指狀和不規(guī)則圓形胞突，基底部伸出錐形或指狀胞突，此處基膜不完整，未見周細胞。血管內(nèi)皮細胞由非色素細胞的樹枝狀胞突所圍繞。

Figure 1 The fibrovascular membranes in NVI(HE，×400)NVI中纖維血管膜(HE，×400)

Figure 2 The vascular membrane in NVI(HE，×400)NVI中血管膜(HE，×400)

Figure 3 The fibrovascular membranes in NVI(TEM，×10 000)NVI中纖維血管膜(TEM，×10 000)

Figure 4 The vascular membrane in NVI(TEM，×10 000)NVI中血管膜(TEM，×10 000)

3 討論

NVI即虹膜紅變，常繼發(fā)于視網(wǎng)膜的缺血缺氧性疾病(視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞、DR等疾病)，而隨著糖尿病發(fā)病率的逐年上升，由DR導致的NVI及新生血管性青光眼的發(fā)病率和致盲率也呈逐年上升趨勢。而針對其病因的研究成為現(xiàn)在防治其發(fā)生的主要途徑。近年研究表明，CTGF有誘導新生血管形成的作用。

早在1991年Bradham等［2］用親和色譜法在人臍靜脈內(nèi)皮細胞條件培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)了CTGF。該因子類屬于 CCN(CTGF、Cyr61、nov)家族［3］，富含半胱氨酸分泌性生長因子，具有刺激成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞的生長、黏附及促進I型膠原等細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)分泌的作用，且參與組織纖維化和新生血管的形成。CTGF的結構特征:CTGF由349個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為(36～38)×103，基因定位于染色體6q23.1，構成它的主要蛋白結構域包括:胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)結合區(qū)，血管性血友病因子(Von Willebrand factor)的C型重復區(qū)，血小板反應蛋白(thrombospondin，TSP)Ι型重復區(qū)［4］，富含半胱氨酸的C末端。CTGF的特異性受體是一種多配基受體，為肝素依賴性的低密度脂蛋白受體相關蛋白/α-2巨球蛋白受體(LRP)［5］。CTGF的生物學特性:CTGF具有加速DNA合成，促進細胞增生［6］，促進細胞黏附［7］，增加血管平滑肌的生長和遷移［8］，促進新生血管形成［9］，刺激 ECM 的生成［10］;ECM 具有促使脈絡膜新生血管生成的作用，而CTGF可促使視網(wǎng)膜色素上皮細胞中ECM含量增加，從而使脈絡膜新生血管形成［11］。在脈絡膜新生血管形成的過程中，CTGF表達增加且對新生血管形成起潛在作用［12］。新生血管形成同時存在ECM的溶解、內(nèi)皮細胞的增殖和遷移以及新基質(zhì)成分的合成。CTGF主要通過調(diào)節(jié)ECM的結構和穩(wěn)定性來促進新生血管的形成，主要表現(xiàn)為直接促進膠原的合成，加速ECM的產(chǎn)生，從而促進血管床的形成。CTGF本身就是一種促新生血管生成的因子，它可促進血管內(nèi)皮細胞形成管腔，在血管生成的各個階段都起到重要作用。此外，CTGF還可通過調(diào)控與新生血管相關的其他生長因子的表達來促進新生血管形成［13］，CTGF所屬蛋白是一種鑲嵌蛋白，CTGF的C末端可作為血管內(nèi)皮細胞的表面配體。在新生血管形成過程中，CTGF和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是同時表達的，且相互影響，現(xiàn)已證明VEGF與CTGF可直接連接形成復合物，調(diào)控與血管新生相關的其他生長因子的表達。CTGF被認為是TGF-β2的下游效應介質(zhì);而 TGF-β2可誘導 CTGF和VEGF表達增加;TGF-β2通過MAPK和PKC途徑使VEGF表達增加;VEGF也可誘導體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞中TGF-β2和CTGF的表達。CTGF、VEGF和TGF-β2均具有刺激新生血管形成、細胞增殖的作用。同時TGF-β2可顯著上調(diào)RPE細胞和成纖維細胞CTGF、VEGF的表達［14］。而缺氧可誘導CTGF表達［15-16］。

現(xiàn)研究表明堿性成纖維細胞生長因子、過氧化氫、γ-8T細胞、糖基化終產(chǎn)物、纖維蛋白酶、草酸鈣晶體、糖皮質(zhì)激素、活性氧、血栓素、機械性循環(huán)張力、前列腺素F2α等物質(zhì)均可誘導CTGF表達;血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、肝細胞生長因子、成纖維細胞生長因子、環(huán)腺苷酸、一氧化氮、維生素 E、己酮可可堿、吡非尼酮等物質(zhì)可抑制CTGF表達。

本實驗表明，2型糖尿病大鼠虹膜中CTGF的含量與NVI的生成有關。正因為CTGF的病理學效應及與其相關的血管增生因子的共同作用引起的DR及NVI形成，從而誘發(fā)新生血管性青光眼，最終導致失明。因此根據(jù)本實驗研究結果，早期若減少CTGF的表達，可預防NVI的產(chǎn)生。這可對糖尿病晚期并發(fā)癥(NVI、新生血管性青光眼)所導致的失明起到預防作用，為糖尿病晚期并發(fā)癥的預防奠定一定的理論基礎。

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