色素上皮衍生因子的表達(dá)與早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)學(xué)的改變△

劉寧寧 才 娜 陳 蕾

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)在糖尿病患者中是常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥，而且在發(fā)達(dá)國(guó)家也是最常見(jiàn)的致盲原因。臨床流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)DR的發(fā)病率高達(dá)38% ～90%［1］。新生血管形成是DR主要的病理性改變，并且是其致盲的主要原因。而糖尿病導(dǎo)致 DR發(fā)病的機(jī)制十分復(fù)雜，目前尚未完全明了。研究發(fā)現(xiàn)新生血管形成因子與抑制因子之間的平衡失調(diào)是新生血管形成的重要機(jī)制，抑制血管增生已經(jīng)成為治療這類疾病的新靶點(diǎn)［2］。色素上皮細(xì)胞衍生因子(pigment epithelium derived factor，PEDF)是目前最有效的血管增生抑制劑之一［3］。本文利用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，用視網(wǎng)膜消化鋪片法觀察微血管變化，原位雜交技術(shù)檢測(cè)PEDF mRNA在大鼠模型中的動(dòng)態(tài)表達(dá)，探討PEDF在新生血管形成中的作用及其與血管本身器質(zhì)性改變的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 12周齡健康Wistar大鼠48只(96眼)，雌雄不限(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量180～220 g。隨機(jī)分成糖尿病1個(gè)月組(DM1)、3個(gè)月組(DM3)、6個(gè)月組(DM6)，正常對(duì)照1個(gè)月組(CON1)、3個(gè)月組(CON3)、6個(gè)月組(CON6)，每組各8只大鼠。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于該中心的標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)房，并飼以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料。鐵籠喂養(yǎng)，不限制食水，自然晝夜光線照明。室內(nèi)通風(fēng)良好。相對(duì)濕度為40% ～70%，室溫保持在18～20℃。

1.2 STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型 按60 mg·kg-1的劑量對(duì)糖尿病各組大鼠行一次性腹腔注射STZ(美國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品，臨用前用0.1 mol·L-1、pH 值4.2 的檸檬酸緩沖液溶解，配制成20 g·L-1STZ溶液)，注射后1周檢測(cè)定性尿糖和血糖。尿糖在+++以上、血糖＞16.7 mmol·L-1者為糖尿病大鼠。成模后每周測(cè)定一次定性尿糖，每個(gè)月測(cè)定一次血糖。

1.3 取材 分別取每組大鼠各8只，過(guò)量麻醉處死后立即取出眼球，左眼用于視網(wǎng)膜消化鋪片，進(jìn)行組織學(xué)觀察;右眼進(jìn)行PEDF mRNA的原位雜交。

1.4 視網(wǎng)膜血管消化鋪片的制作與觀察 左眼眼球用體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定48 h，參照張惠蓉等［4］介紹的方法制作大鼠視網(wǎng)膜血管消化鋪片，常規(guī)PAS染色。將標(biāo)本置于光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)取5個(gè)視野，油鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)視野中周細(xì)胞數(shù)量，取其平均值，所有數(shù)據(jù)均行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.5 PEDF mRNA的原位雜交 組織切片用胃蛋白酶消化后，滴加預(yù)雜交液，37℃下預(yù)雜交4 h，恒溫箱37～42℃孵育4 h;滴加20 μL雜交液，37℃下雜交過(guò)夜;雜交后洗滌，滴加生物素化鼠抗地高辛后，滴加生物素化過(guò)氧化物酶，DAB顯色;隨機(jī)取5個(gè)視野，光鏡下觀察PEDF mRNA在不同病程的糖尿病大鼠以及正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜的表達(dá)情況，用單位面積(1 mm×1 mm)視網(wǎng)膜PEDF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)反映PEDF mRNA在視網(wǎng)膜的定量表達(dá);與陰性對(duì)照片相比，判定著色部位的陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)度(陽(yáng)性度)反映PEDF的定性表達(dá)。按照陽(yáng)性反應(yīng)部位(胞漿)為淺黃色、黃色、棕黃色、褐色分為 +、++、+++、++++四個(gè)等級(jí)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CON1組和DM1組大鼠各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

DM1組視網(wǎng)膜血管鋪片可見(jiàn):低倍鏡下可見(jiàn)較完整的血管網(wǎng)。高倍鏡下可見(jiàn)毛細(xì)血管由周細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞組成，周細(xì)胞核小呈圓形，多位于毛細(xì)血管一側(cè);內(nèi)皮細(xì)胞核較大，呈橢圓形或不規(guī)則形，長(zhǎng)軸與毛細(xì)血管平行，一般位于毛細(xì)血管中央部位，未見(jiàn)到有閉塞的毛細(xì)血管(圖1)。周細(xì)胞數(shù):CON1組6.45 ±0.64，DM1 組6.52 ±0.75，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。原位雜交染色結(jié)果表明:PEDF mRNA在節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層及視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)層均有表達(dá)(圖2)，PEDF mRNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù):DM1組53±8，與CON1組(64±10)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.342，P ＞0.05)。

2.2 CON3組與DM3組大鼠各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

DM3組視網(wǎng)膜血管鋪片可見(jiàn):毛細(xì)血管迂曲，走行不規(guī)則，毛細(xì)血管管腔粗細(xì)不一。DM3組周細(xì)胞數(shù)(6.06 ±0.65)較 CON3 組(6.51 ±0.70)減少(P ＜0.05)。原位雜交染色結(jié)果表明:PEDF mRNA在節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層、RPE層陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)減少，DM3組為49±12，與CON3組(68±11)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.213，P ＜0.05)。

2.3 CON6組與DM6組大鼠各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

DM6組視網(wǎng)膜血管鋪片可見(jiàn):視網(wǎng)膜血管形態(tài)改變程度嚴(yán)重，可見(jiàn)退化中較長(zhǎng)的毛細(xì)血管，管腔為閉鎖狀(圖3)。DM6 組周細(xì)胞數(shù)(5.45 ±0.80)較 CON6 組(6.47 ±0.60)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。原位雜交染色結(jié)果表明:PEDF mRNA在內(nèi)核層和節(jié)細(xì)胞層陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)減少更顯著(圖4)，RPE層只見(jiàn)極少陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，CON6組58±8，與DM6組(34±14)相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.099，P ＜0.01)。

3 討論

視網(wǎng)膜毛細(xì)血管主要由周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞組成，周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的功能完整對(duì)維持視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的穩(wěn)定性十分重要。研究表明，毛細(xì)血管周細(xì)胞可能是一種多功能前體細(xì)胞，在合適生理或病理?xiàng)l件下能分化成其他間質(zhì)細(xì)胞［5］(如平滑肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等)。周細(xì)胞具有調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、新生血管生長(zhǎng)、毛細(xì)血管血流、通透性及穩(wěn)定性等多種功能［6-7］。有研究表明［8］，周細(xì)胞與DR的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。DR是以微血管病變以及新生血管形成為主要標(biāo)志的疾病。從形態(tài)學(xué)角度觀察微血管變化的方法很多，其中視網(wǎng)膜血管消化鋪片是較好的一種方法。血管新生主要靠?jī)?nèi)皮細(xì)胞的增殖來(lái)實(shí)現(xiàn)，但受周?chē)h(huán)境影響較大，如周細(xì)胞及細(xì)胞間質(zhì)等。DR病變?cè)缙诘男螒B(tài)學(xué)變化之一是周細(xì)胞數(shù)量減少，這曾被認(rèn)為是DR發(fā)病的一個(gè)始動(dòng)因素。因?yàn)橹芗?xì)胞含有類似于平滑肌結(jié)構(gòu)的肌動(dòng)蛋白微絲——Actin，它是一種參與細(xì)胞分化、連接和運(yùn)動(dòng)的骨架蛋白，具有收縮功能，對(duì)維持視網(wǎng)膜血管的正常舒縮、血流量調(diào)節(jié)具有特殊意義。周細(xì)胞對(duì)血管活性調(diào)節(jié)因子的反應(yīng)可能與早期DR有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)觀察到周細(xì)胞數(shù)量隨著STZ大鼠的病程而改變，CON1與DM1組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而此時(shí)PEDF mRNA已開(kāi)始表達(dá)。隨著病程延長(zhǎng)，DM3組和DM6組周細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始較對(duì)照組減少，PEDF mRNA陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)減少。這說(shuō)明周細(xì)胞數(shù)量減少與PEDF分泌減少有一致性，原因可能是高糖造成視網(wǎng)膜血管周細(xì)胞凋亡，其對(duì)血管收縮功能及調(diào)節(jié)血流量的功能下降，同時(shí)慢性持續(xù)的高糖也可誘發(fā)血流的改變及血液流變學(xué)異常。隨著糖尿病病程的延長(zhǎng)，視網(wǎng)膜血流的減少導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血進(jìn)而引起PEDF分泌減少，促進(jìn)了DR的新生血管產(chǎn)生。

Figure 1 Photograph of PAS staining of diabetic rat’s retina in 1 month(DM1).It was found that the retinal capillary caliber is regularity(PAS，×400).圖1 DM1組:視網(wǎng)膜血管消化鋪片PAS染色結(jié)果，可見(jiàn)視網(wǎng)膜毛細(xì)血管管徑粗細(xì)均一(PAS，×400)。

Figure 2 Photograph of in situ hybridization of PEDF of DM1.The PEDF mRNA positive expression appeared in ganglion cell layer and inner nuclear layer and RPE layer(DAB，×200).圖2 DM1組:PEDF原位雜交染色結(jié)果，PEDF mRNA在節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層及RPE層均有表達(dá)(DAB，×200)。

Figure 3 Photograph of PAS staining of diabetic rat’s retina in 6 month(DM6).It was found that the acellular capillary appeared in DM6(white arrow，PAS，×400);圖3 DM6組:視網(wǎng)膜血管消化鋪片PAS染色結(jié)果，可見(jiàn)無(wú)細(xì)胞毛細(xì)血管形成(白箭頭，PAS，×400)。

Figure 4 Photograph of in situ hybridization of PEDF of DM6.The PEDF mRNA positive expression appeared only in ganglion cell layer and inner nuclear layer(DAB，×200)圖4 DM6組:PEDF原位雜交染色結(jié)果，PEDF mRNA僅在節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層有表達(dá)(DAB，×200)

PEDF是1989年Tombran-Tink等最初從胎兒RPE細(xì)胞培養(yǎng)液中分離出來(lái)的，具有神經(jīng)保護(hù)作用。Dawson等［9］發(fā)現(xiàn)PEDF存在于角膜、玻璃體等眼內(nèi)組織無(wú)血管組織內(nèi)，推測(cè)其具有很強(qiáng)的抑制血管作用，他們將視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞放在含體積分?jǐn)?shù)0.5%氧氣的低氧環(huán)境中，低氧使 VEGF升高9.5倍、而PEDF降低11.8倍左右。國(guó)外有學(xué)者用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定經(jīng)玻璃體切割術(shù)后玻璃體中PEDF含量，其中增殖性 DR 為(0.88 ±0.21)g·L-1，非增殖性 DR 為(2.43 ±0.37)g·L-1，這表明 PEDF 抑制新生血管生成，其含量減少可減弱其抑制的缺血缺氧狀態(tài)下新生血管形成的作用。

綜上所述，在DR進(jìn)展中，周細(xì)胞數(shù)量減少，視網(wǎng)膜血管發(fā)生改變，視網(wǎng)膜缺血缺氧，導(dǎo)致PEDF分泌減少，但血管的這些異常改變是否僅與周細(xì)胞減少及PEDF分泌減少有關(guān)尚需進(jìn)一步研究。同時(shí)PEDF具有高效的抗血管生成活性［10-11］，成為治療血管增生性疾病的候選藥物。在視網(wǎng)膜的一些致盲眼病中，視網(wǎng)膜新生血管是一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。用PEDF抑制視網(wǎng)膜新生血管的形成，從而控制疾病的發(fā)展，成為最近眼科領(lǐng)域研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

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