免疫金層析技術(shù)快速檢測(cè)副溶血弧菌方法的初步研究*

孔繁德 劉陽(yáng)， 徐淑菲 彭小莉 吳德峰 林 立

免疫金層析技術(shù)快速檢測(cè)副溶血弧菌方法的初步研究*

孔繁德1劉陽(yáng)1，2徐淑菲1彭小莉1吳德峰2林 立1

1.廈門(mén)出入境檢驗(yàn)檢疫局；2.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院

本研究應(yīng)用兔抗IgG-2包被硝酸纖維素膜檢測(cè)線，羊抗兔IgG包被對(duì)照線，膠體金標(biāo)記兔抗IgG-1，建立了檢測(cè)副溶血弧菌（）的免疫金層析試紙條法（IGCA）。結(jié)果表明，陽(yáng)性者試紙條檢測(cè)線和對(duì)照線均出現(xiàn)紅色線，實(shí)驗(yàn)過(guò)程僅需5～15min即可判斷結(jié)果，該法對(duì)的最低檢測(cè)量為3.60×104cfu/mL，與溶藻弧菌、霍亂弧菌、美人魚(yú)弧菌、麥?zhǔn)匣【?、弗氏枸櫞酸桿菌和沙門(mén)菌等常見(jiàn)腸道菌不發(fā)生交叉反應(yīng)。將試紙條4℃存放6個(gè)月、常溫存放3個(gè)月，37℃存放1個(gè)月，檢測(cè)結(jié)果無(wú)差異。說(shuō)明建立的試紙條檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，結(jié)果容易觀察和判斷，非常適于基層養(yǎng)殖部門(mén)應(yīng)用。

副溶血弧菌 膠體金 免疫層析

副溶血弧菌(，簡(jiǎn)稱)最早是由Fujino等[1]于1953年從日本一個(gè)食物中毒患者身上初次分離得到的，是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，常呈多態(tài)性，有鞭毛，無(wú)莢膜和芽孢。在含3%～5%的食鹽培養(yǎng)基中，pH7.5-8.5及37℃條件下，生長(zhǎng)最為良好并且對(duì)酸敏感。該菌分布于世界各地，通常廣泛分布于近海區(qū)域、鹽湖及魚(yú)、貝類等海產(chǎn)品中，是沿海地區(qū)引起食物中毒的重要病原菌，在食物中的數(shù)量超過(guò)106即可導(dǎo)致患者出現(xiàn)腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐和頭疼等典型胃腸炎反應(yīng)，嚴(yán)重者可引起敗血癥甚至死亡，也曾有發(fā)燒和發(fā)冷的報(bào)道，但較少。我國(guó)沿海地區(qū)每年都有因副溶血性弧菌引起食物中毒的報(bào)道。1998年以來(lái)的資料顯示，副溶血弧菌引發(fā)食物中毒的規(guī)模呈明顯的上升趨勢(shì)，已超過(guò)沙門(mén)菌食物中毒，躍居首位[2]。為有效控制副溶血弧菌病原的發(fā)生擴(kuò)散，準(zhǔn)確即時(shí)的檢測(cè)手段正是預(yù)防控制、傳播的關(guān)鍵所在。

目前，V.parahaemolyticus的檢測(cè)技術(shù)主要有傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫吸附 (ELISA )法[3]和免疫熒光抗體技術(shù)[4]，也有現(xiàn)代的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[5]、PCR技術(shù)[6-10]、熒光定量PCR技術(shù)[11-12]、UPPCR-SSCP技術(shù)[13]、變性高效液相色譜（DHPLC）技術(shù)[14]和Transcription- reverse transcription concerted(TRC)方法[15]、DNA指紋圖譜技術(shù)[16]等。但綜合來(lái)看，以上介紹的各種方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，在快速檢測(cè)、定性和精確定量方面難以兼顧。傳統(tǒng)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，對(duì)于需要檢測(cè)大量樣本的出入境檢疫、食品、衛(wèi)生以及獸醫(yī)部門(mén)的實(shí)驗(yàn)室是一種沉重的負(fù)擔(dān)，不僅影響檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的工作效率，而且使生產(chǎn)部門(mén)的產(chǎn)品運(yùn)輸和倉(cāng)儲(chǔ)時(shí)間延長(zhǎng)，生產(chǎn)成本加大。因此，快速檢測(cè)方法方面的研究越來(lái)越受到關(guān)注。

目前快速檢測(cè)研究主要集中在膠體金試紙條、斑點(diǎn)金滲濾法、免疫熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、PCR和熒光PCR等方法上，其中免疫熒光技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)需要一定的操作經(jīng)驗(yàn)和儀器設(shè)備，而分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，如PCR和熒光PCR，則更需要專業(yè)技術(shù)和檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)以及較昂貴的檢測(cè)設(shè)備，難以在口岸一線部門(mén)和基層養(yǎng)殖部門(mén)推廣使用。免疫膠體金技術(shù)是20世紀(jì)90年代以來(lái)繼三大標(biāo)記技術(shù)（熒光素、放射性同位素和酶）后發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新型體外固相標(biāo)記免疫診斷技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏、可現(xiàn)場(chǎng)操作等優(yōu)點(diǎn)[17-18]，適應(yīng)于口岸快速檢測(cè)的需要。本研究旨在以為試驗(yàn)材料，制備兔抗副溶血弧菌多克隆抗體，利用先進(jìn)的膠體金生產(chǎn)工藝來(lái)研制檢測(cè)的金標(biāo)檢測(cè)試紙條。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器主要有高速冷凍離心機(jī)(Backman)、硝酸纖維素膜（美國(guó)Millipore公司）、玻璃纖維膜（上海金標(biāo)生物科技公司）、吸水紙、透析袋等；試劑均為分析純，氯金酸（上海市試劑總廠化學(xué)試劑一廠產(chǎn)品）、檸檬酸三鈉、酪蛋白、牛血清白蛋白、羊抗兔IgG、碳酸鉀等，膠體金稀釋液（含1％BSA，0.05％PEG20000，5％蔗糖，0.05%Tween-20的0.01mol/L pH7.2的PBS緩沖液）。

1.2 菌株

副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌、麥?zhǔn)匣【?、沙門(mén)菌、枸櫞酸桿菌各1株，均由廈門(mén)出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 兔抗副溶血弧菌多克隆抗體的制備與純化

參照文獻(xiàn)[19]中的方法稍作改進(jìn)，將純化好的副溶血弧菌接種3.5%堿性蛋白胨水，37℃培養(yǎng)18～24h后，用終濃度為0.3%的甲醛滅活24 h后取少量滅活菌液接種3.5%堿性蛋白胨水37℃培養(yǎng)24h后，檢測(cè)滅活是否徹底。將滅活后的菌體用滅菌生理鹽水洗滌三遍，然后再用含雙抗的滅菌生理鹽水稀釋到原體積的1/10，將此滅活的菌液混勻后用于免疫家兔，采用背部皮下多點(diǎn)注射和靜脈直接注射兩種免疫方式，其中皮下多點(diǎn)注射為將菌液用弗氏完全佐劑等體積混勻后背部皮下多點(diǎn)注射4mL，2周后菌液用弗氏不完全佐劑等體積混勻后再次背部皮下多點(diǎn)注射4mL，2周后采血前5～7天靜脈注射4mL，當(dāng)凝集效價(jià)達(dá)到1:1280或1:2560時(shí)采血，所得抗體為兔抗IgG-1（簡(jiǎn)稱兔抗-1）；靜脈直接注射法，每10 d注射一次，首次注射1mL，第二、三、四次劑量依次為1.5、2、3mL，當(dāng)凝集效價(jià)達(dá)到1:1280或1:2560時(shí)采血，所得抗體為兔抗IgG-2（簡(jiǎn)稱兔抗-2）。將采集的血液放4℃過(guò)夜，次日3000 r/min離心10 min，分離血清，采用飽和硫酸銨沉淀法純化[20]，然后用溶藻弧菌、霍亂弧菌、麥?zhǔn)匣【⑸抽T(mén)菌、枸櫞酸桿菌等菌體常溫振蕩吸附2～3 h，SDS-PAGE鑒定純度[21]，直接血凝試驗(yàn)測(cè)定效價(jià)[22]。

1.4 膠體金的制備和金標(biāo)多抗的制備

參照文獻(xiàn)[23]的檸檬酸鈉還原法并稍作改進(jìn)，準(zhǔn)確量取99 mL經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾的去離子雙蒸水加入到處理干凈的三角錐形瓶中，再取1mL 1%氯金酸加入錐形瓶中，所得氯金酸溶液濃度為0.01%，置于磁力攪拌鍋中加熱至沸騰，在磁力攪拌器攪拌下快速加入2 mL的1%檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)攪拌加熱煮沸，待溶液變?yōu)槠咸丫萍t色后再繼續(xù)加熱煮沸5～8 min。經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)其吸收峰在520nm處，得到的膠體金顆粒直徑約為20nm左右，冷卻后置于4℃冰箱中避光保存。

將制備好的膠體金用0.1mol/L K2CO3調(diào)節(jié)pH至8.5[24]，取制備量的膠體金溶液，在磁力攪拌下逐滴加入純化的兔抗-1（按每毫升膠體金溶液加入16.7μg純化的兔抗-1），繼續(xù)磁力攪拌30 min后加入經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾的5%PEG（MW6000）至終濃度為0.1%，繼續(xù)磁力攪拌15min，最后放置4℃冰箱，靜置過(guò)夜。次日將標(biāo)記好的膠體金于4000 r/min離心10 min，取上清于15000 r/min離心30 min，小心吸棄上清，沉淀用膠體金稀釋液恢復(fù)到原體積的1/20，置4℃冰箱備用。

1.5 金標(biāo)快速檢測(cè)試紙條的組裝

把金標(biāo)兔抗-1處理過(guò)的樣品墊（玻璃纖維膜）、吸水紙、檢測(cè)線（T線）（包被兔抗-2）和對(duì)照線（C線）（包被羊抗兔IgG）已包被好的硝酸纖維素膜（NC膜）按順序貼到不干膠底板上，切割成條，分裝到裝有干燥劑的鋁箔袋中密封。

1.6 膠體金免疫層析試紙條法（IGCA）最佳條件的確定[17-18]

1.6.1 最佳封閉液的選擇

將T、C線已包被好相應(yīng)成分的NC膜用不同配方的封閉液封閉，烘干后組裝成試紙條進(jìn)行IGCA實(shí)驗(yàn)，并將試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，選擇條帶顏色清晰且背景較淺的一組封閉液配方作為最適封閉液。

1.6.2 各成分最佳濃度和靈敏度的測(cè)定

分別把金標(biāo)兔抗-1、兔抗-2和羊抗兔IgG按一定的比例進(jìn)行稀釋，組合成方陣，包被在玻璃纖維膜、檢測(cè)線（T線）和對(duì)照線（C線）上，制成不同濃度的試紙條組合，然后用10倍梯度稀釋的副溶血弧菌懸液進(jìn)行檢測(cè)，以得出最佳組合。

1.6.3 特異性試驗(yàn)

用上述條件優(yōu)化后制備組裝的試紙條，檢測(cè)副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌、美人魚(yú)弧菌、弗氏枸櫞酸桿菌和沙門(mén)氏菌，觀察結(jié)果。

1.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將在同一時(shí)間按優(yōu)化后的條件制備的試紙條平均分成三批，分裝到裝有干燥劑的鋁箔袋中密封，然后分別置4℃冰箱、室溫和37℃培養(yǎng)箱中保存，冰箱的每隔1個(gè)月取出2條，室溫和培養(yǎng)箱的每隔1周取出2條，進(jìn)行副溶血弧菌陽(yáng)性檢測(cè)，測(cè)試時(shí)間9個(gè)月，觀察T、C線。

1.6.5 臨床試驗(yàn)

進(jìn)口冷凍帶魚(yú)、魷魚(yú)和墨魚(yú)，活甲魚(yú)、甲魚(yú)蛋、螃蟹和蝦等100份樣品，用試紙條法檢測(cè)，同時(shí)與傳統(tǒng)檢測(cè)方法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳封閉液的選擇

T、C線包被好的NC膜分別用以下8種封閉液進(jìn)行封閉：(1)1%BSA、0.5%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS；(2)0.5%BSA、0.5%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS；(3)1%BSA、0.05%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS；(4)0.5%BSA、0.05%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS；(7)1%casein、0.5%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS。(8)0.5% casein、0.5%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS；(9)1% casein、0.05%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS；(10)0.5% casein、0.05%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS。結(jié)果顯示，用含1% casein、0.05%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS封閉效果最好，斑點(diǎn)顯色清楚，背景較淺。如圖1所示。

1-4，7-10分別為（1）-（4），（7）-（10）號(hào)封閉液

2.2 試紙條的最佳條件和靈敏度的確定

通過(guò)T線包被兔抗-2的抗體濃度為0、24.32、48.64、72.96、97.28、121.6、145.92、170.24mg/mL的8個(gè)濃度梯度，金標(biāo)兔抗-1的體積為標(biāo)記前膠體金體積的1/5、1/10、1/15、和1/20時(shí)，組合組裝成方陣試紙條，然后用10倍系列稀釋的副溶血弧菌菌懸液進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果當(dāng)T線兔抗-2濃度為121.6mg/mL以上，金標(biāo)兔抗-1的體積為標(biāo)記前膠體金體積的1/15時(shí)，菌液濃度最低為3.592×106cfu/mL時(shí)檢測(cè)線顯色較清楚，并且靈敏度可達(dá)到3.592×104cfu/mL(見(jiàn)圖2)。

對(duì)照線包被羊抗兔IgG，濃度為0、2、4、6、8、10 mg/mL的6個(gè)濃度梯度，再用前面確定的兔抗-2和金標(biāo)兔抗-1的最佳濃度進(jìn)行反應(yīng)，最后得出C線包被羊抗兔IgG的最低濃度為6mg/mL（見(jiàn)圖3）。

因此最終確定試紙條T線兔抗-2的濃度為121.6mg/mL，C線包被羊抗兔IgG的濃度為6mg/mL，金標(biāo)兔抗-1稀釋為標(biāo)記前體積的1/15時(shí)顯示最佳檢測(cè)效果，并且靈敏度可達(dá)到3.592×104cfu/mL。

1-6：V.parahaemolyticus的菌液濃度依次為3.592×108，3.592×107，3.592×106，3.592×105，3.592×104，3.592×103 cfu/mL

0、2、4、6、8、10依次為C線劃線濃度0、2、4、6、8、10 mg/mL

2.3 試紙條的特異性

檢測(cè)副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌、美人魚(yú)弧菌、麥?zhǔn)匣【?、弗氏枸櫞酸桿菌、沙門(mén)菌7株菌株，只有的C、T線，均出現(xiàn)紫紅色線，顯示陽(yáng)性結(jié)果；而其余6株菌株只有C線出現(xiàn)紫紅色線，T線沒(méi)有出現(xiàn)紫紅色線，顯示陰性結(jié)果，如圖4所示。

1-7依次為沙門(mén)氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、麥?zhǔn)匣【?、美人魚(yú)弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌

2.4 試紙條的穩(wěn)定性

測(cè)試期間，4℃密封放置6個(gè)月、室溫密封放置3個(gè)月、37℃溫箱密封放置1個(gè)月檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有異常變化，監(jiān)測(cè)試紙條放置4℃保存比較穩(wěn)定。

2.5 臨床試驗(yàn)

用試紙條法檢測(cè)進(jìn)口冷凍帶魚(yú)、魷魚(yú)和墨魚(yú)，活甲魚(yú)、甲魚(yú)蛋、螃蟹和蝦等100份樣品，結(jié)果從進(jìn)口甲魚(yú)中檢出2份副溶血弧菌陽(yáng)性和3份溶藻弧菌陽(yáng)性，從進(jìn)口螃蟹中檢出1份副溶血弧菌陽(yáng)性和2份溶藻弧菌陽(yáng)性，檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)細(xì)菌分離鑒定結(jié)果完全吻合，但檢測(cè)時(shí)間從常規(guī)檢測(cè)時(shí)間至少4d縮短為2d內(nèi)，大大加快了檢測(cè)進(jìn)程。

3 討論

副溶血弧菌是一種廣泛分布于海洋與鹽湖的嗜鹽性細(xì)菌，能引起蝦、蟹及海產(chǎn)貝類患病。該菌也是引起人類食源性疾病的主要病原之一，是我國(guó)沿海地區(qū)食物中毒和夏季腹瀉的重要病，嚴(yán)重威脅人們的身體健康并造成經(jīng)濟(jì)財(cái)產(chǎn)的巨大損失[3]。1998年以來(lái)的數(shù)據(jù)顯示，副溶血弧菌性食物中毒的發(fā)生規(guī)模及人群暴露規(guī)模呈明顯上升趨勢(shì)，已超過(guò)沙門(mén)氏菌食物，躍居細(xì)菌性中毒的首位。

為有效控制病原的發(fā)生擴(kuò)散，有一個(gè)準(zhǔn)確即時(shí)的檢測(cè)手段正是預(yù)防控制VP傳播的關(guān)鍵所在。近十幾年，對(duì)副溶血弧菌的檢測(cè)方法已從常規(guī)的培養(yǎng)檢測(cè)發(fā)展到以免疫學(xué)或DNA為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)。前者分離培養(yǎng)病原菌需要時(shí)間較長(zhǎng)，而許多傳染病在2~3d內(nèi)就能造成很大的損失；免疫PCR技術(shù)和PCR-ELISA 技術(shù)雖然具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，以及不受病原發(fā)育時(shí)期的限制和不受環(huán)境影響的優(yōu)點(diǎn)，但因使用的儀器精密、藥品昂貴，同時(shí)檢測(cè)程序復(fù)雜，要得到普及和廣泛使用尚有一定難度；酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)技術(shù)(ELISA)，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高和可重復(fù)性強(qiáng)等特點(diǎn)，并且易制成檢測(cè)特定種類病原菌的商品性試劑盒，更適合于野外操作及大量樣品的檢測(cè)，在病原性弧菌檢測(cè)中有著突出的優(yōu)點(diǎn)，但該方法檢測(cè)所用的聚苯乙烯酶標(biāo)板是一種良好的固相載體，對(duì)蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的物理吸附能力，但對(duì)顆粒性抗原如細(xì)菌等的吸附較差，直接將其包被在酶標(biāo)板上較為困難[3]。

膠體金技術(shù)是目前比較常見(jiàn)的標(biāo)記技術(shù)，自1971年Faulk和Taylon[25]用兔抗沙門(mén)氏菌抗血清與膠體金顆粒結(jié)合制成金標(biāo)抗體檢測(cè)沙門(mén)氏菌表面抗原的分布，40多年來(lái)膠體金標(biāo)記技術(shù)得到不斷的發(fā)展和成熟，這期間該技術(shù)發(fā)展到透射電鏡、掃描電鏡等各領(lǐng)域。它是繼三大免疫標(biāo)記技術(shù)之后又一較為成熟地得到廣泛應(yīng)用的免疫標(biāo)記技術(shù)。

目前副溶血弧菌的檢測(cè)方法很多，但是大多操作較復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)、需要特異的引物、昂貴的試驗(yàn)儀器和專業(yè)的實(shí)驗(yàn)人員等因素導(dǎo)致這些方法不能適應(yīng)現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)要求。本研究利用膠體金為示蹤物，采用副溶血弧菌的兔多克隆抗體運(yùn)用雙抗夾心法成功研制了副溶血弧菌免疫層析試紙條。本試紙條法檢測(cè)副溶血弧菌的靈敏度可達(dá)3.592×104cfu/mL，與已知亞型副溶血弧菌呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，而與其它細(xì)菌無(wú)交叉反應(yīng)。試紙條在4℃和室溫存放數(shù)月，檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有顯著變化，說(shuō)明其具有較好的穩(wěn)定性。對(duì)臨床采集樣品陽(yáng)性檢出率高。由此可見(jiàn)，本研究研制的試紙條具有特異性強(qiáng)、敏感度高、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)單、可現(xiàn)場(chǎng)操作、無(wú)需任何儀器和專業(yè)人員、可憑肉眼在30min內(nèi)判定結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)，如果將此方法進(jìn)行改良制備成商品試劑盒，不僅較其它方法快速準(zhǔn)確，而且可大幅度降低檢驗(yàn)成本，減少勞動(dòng)強(qiáng)度，省時(shí)省料，更適合于野外操作及大批量、大范圍的樣品檢測(cè)，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)副溶血弧菌病的快速、準(zhǔn)確診斷，特別適合于在基層單位推廣使用，具有良好的應(yīng)用前景。

綜上所述，本研究建立的副溶血弧菌免疫金試紙條檢測(cè)方法，與傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法和生化鑒定相比，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高，方便快捷、成本低等特點(diǎn)，為副溶血弧菌的檢測(cè)提供了新的發(fā)展方向，有望成為簡(jiǎn)易的常規(guī)檢測(cè)手段，尤其適用于基層檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)，對(duì)于海產(chǎn)品中副溶血弧菌的監(jiān)控檢測(cè)和養(yǎng)殖業(yè)健康持續(xù)發(fā)展，提高食品衛(wèi)生水平，保證食品安全和推動(dòng)食品國(guó)際貿(mào)易發(fā)展具有重要的意義。

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國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2010IK016）。