正交試驗法優(yōu)選茜草配方顆粒的提取工藝

蔡樂 古今 項菲菲 劉萍

茜草為茜草科植物RubiacordifoliaL.的干燥根及根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有涼血、化瘀、止血、通經(jīng)之功效，被廣泛應(yīng)用于治療吐血、衄血、跌打損傷、經(jīng)閉瘀阻等癥。全國幾乎都有茜草分布，其中河北、山西、山東、陜西和河南等省為茜草的主要產(chǎn)地[1]。其主要成分包括大葉茜草素和羥基茜草素等醌類物質(zhì)。將茜草制成配方顆粒劑，取代茜草飲片，可免去患者自行煎煮的過程，方便患者使用。本文通過正交試驗對茜草配方顆粒的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)選，為生產(chǎn)工藝參數(shù)的確定提供實驗依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試藥

茜草飲片(由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司提供)經(jīng)解放軍總醫(yī)院劉萍主任藥師鑒定為茜草科植物茜草(RubiacordifoliaL.)的干燥根及根莖。大葉茜草素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110884-200604)；羥基茜草素(Sigma公司，批號：MKBC4162V)；乙腈、甲醇為色譜純；磷酸為分析純；水為重蒸餾水。

1.2 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括1200系列四元梯度泵、自動進(jìn)樣器、二極管陣列檢測器、化學(xué)工作站(美國 Agilent 公司)；Sartorius CP 225D天平等。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗設(shè)計

配方顆粒的提取溶劑均規(guī)定為水，采用先浸泡再加熱提取的方法提取。根據(jù)預(yù)試驗的結(jié)果，以加水倍量(A)、提取次數(shù)(B)和提取時間(C)為考察因素，選取干浸膏得率、大葉茜草素和羥基茜草素提取量為評價指標(biāo)，設(shè)計正交試驗，采用L9(34)正交表優(yōu)選水提茜草的最佳提取工藝條件，因素水平表見表 1。

表1 正交試驗因素水平表

2.2 干浸膏得率測定方法

將各次試驗提取的藥液濾過、濃縮、定容至250 ml，精密吸取10 ml置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘渣于105℃干燥至恒重，取出，于干燥器中放置約30分鐘至室溫后，迅速精密稱定質(zhì)量并計算干浸膏得率。

2.3 大葉茜草素和羥基茜草素的測定

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥12小時的大葉茜草素對照品25 mg，置5 ml量瓶中，加甲醇制成每1 ml含大葉茜草素5 mg的貯備液A。精密稱取羥基茜草素10 mg，置10 ml量瓶中，加甲醇制成每1 ml含羥基茜草素1 mg的貯備液B。分別精密移取50 μl貯備液A和100 μl貯備液B，置50 ml量瓶中，加甲醇制成每1 ml含大葉茜草素和羥基茜草素分別為5 μg和2 μg的混合溶液C，搖勻，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 將各次試驗提取的藥液濾過、濃縮、定容至250 ml，吸取藥液各2 ml，高速離心(10000轉(zhuǎn)/分)15分鐘，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜濾過。精密吸取濾液10 μl，注入高效液相色譜儀測定大葉茜草素和羥基茜草素的含量。

2.3.3 色譜條件及適用性 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-乙腈-0.2%磷酸，采用梯度洗脫的方法，0～13分鐘配比為25∶35∶40，13～15分鐘配比調(diào)整至25∶52∶23，15～35分鐘配比保持為25∶52∶23；流速：1.0 ml/min；檢測波長為250 nm；柱溫：30℃。進(jìn)樣量10 μl。在此色譜條件下，羥基茜草素和大葉茜草素的保留時間分別為12.2 分鐘和30.1 分鐘左右，其他色譜峰對羥基茜草素和大葉茜草素的峰無干擾，峰形尖銳，基線平穩(wěn)。色譜圖見圖1。

圖1 對照品溶液(a)與供試液(b)的高效液相色譜圖(Ⅰ：羥基茜草素；Ⅱ：大葉茜草素)

2.3.4 線性關(guān)系與范圍的考察 精密吸取適量貯備液A和B，加甲醇配制成含大葉茜草素和羥基茜草素濃度分別為0.5/0.4、1/0.8、2/2、5/4、10/8、20/20 μg/ml的6組標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。分別精密吸取各濃度標(biāo)準(zhǔn)系列溶液10 μl，按上述色譜條件進(jìn)行測定。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得大葉茜草素的回歸方程為Y=29.040X-0.6080 (r=0.9998)；羥基茜草素的回歸方程為Y=36.468X-5.2430(r=0.9999)。結(jié)果表明，大葉茜草素在0.5～20 μg/ml范圍內(nèi)，羥基茜草素在0.4～20 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度試驗 取“2.3.1”項下混合對照品溶液C，在上述色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣5次測定，計算大葉茜草素和羥基茜草素的峰面積RSD(n=5)分別為0.34%和0.57%，表明儀器精密度良好。

表2 正交試驗結(jié)果

2.3.6 重復(fù)性試驗 取同一批樣品，共5份，分別按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測定，計算大葉茜草素和羥基茜草素的峰面積RSD(n=5)分別為2.07%和2.09%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗 取已知含量的茜草干浸膏6份，每份約0.1 g，精密稱定，精密加入大葉茜草素和羥基茜草素對照品適量，加重蒸餾水定容至25 ml，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測定，并計算加樣回收率。大葉茜草素和羥基茜草素的平均回收率分別為102.8%(RSD=1.59%)和98.1%(RSD=1.76%)。

2.4 正交試驗方法及結(jié)果

稱取 10 g 茜草飲片共 9 份，浸泡 2小時后，采用L9(34)正交表安排試驗(表2)，微沸回流提取，制得茜草水提取液。將提取液過濾、濃縮、定容至 250 ml后，按“2.2”和“2.3”項下方法測定干浸膏得率及大葉茜草素和羥基茜草素的提取量。將干浸膏得率、大葉茜草素和羥基茜草素提取量等3個指標(biāo)轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的隸屬度，計算方法為：指標(biāo)隸屬度 = (指標(biāo)值-指標(biāo)最小值)/(指標(biāo)最大值-指標(biāo)最小值)[2]，按照各指標(biāo)隸屬度的權(quán)重系數(shù)(0.5∶0.25∶0.25)計算綜合評分，并對實驗結(jié)果進(jìn)行分析。見表2。為進(jìn)一步確定各因素對結(jié)果的影響大小，對試驗結(jié)果進(jìn)行了方差分析。見表3。

表3 方差分析表

注:F0.05(2，2)=19.00；F0.01(2，2)=99.00

極差分析結(jié)果表明，3個因素的影響大小依次為：提取次數(shù)(B)>加水量(A)>提取時間(C)；表3方差分析結(jié)果表明，提取次數(shù)(B)和加水量(A)2個因素對水提工藝有顯著性影響，其中提取次數(shù)(B)的影響有極顯著差異，而提取時間(C)影響較小，由此得出的最佳工藝組合為A3B3C2，即以12倍量水，煎3次，每次1.5小時，但這一組合的生產(chǎn)周期長、用水量大，將增加生產(chǎn)成本，同時也不符合節(jié)能降耗的原則。

由于提取時間這一因素對試驗結(jié)果的影響程度最小，因此考慮選取更為經(jīng)濟(jì)的水平；雖然加水量因素對試驗結(jié)果的影響顯著，但通過直觀分析發(fā)現(xiàn)加水量為10倍量和12倍量這2個水平間的差異卻很小，在保證提取充分的前提下，考慮到縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本等生產(chǎn)實際的需要，選擇A2B3C1組合作為水提取工藝參數(shù)，即飲片加入10倍量水，煮沸后保持微沸1小時，提取3次。

2.5 驗證試驗

為確定優(yōu)選工藝的優(yōu)劣和穩(wěn)定性，以A2B3C1組合進(jìn)行了3批驗證試驗，由表4結(jié)果可見，此工藝穩(wěn)定可靠，合理可行。

表4 水煎煮提取優(yōu)選工藝驗證實驗結(jié)果

3 討論

中藥配方顆粒是中藥飲片改革的一種新形式，它保持了中藥湯劑的特點，且有所專長，具有“三效”(高效、速效、長效)、“三小”(劑量小、毒性小、作用小)以及“五方便”(服用、攜帶、貯藏、組方、運輸方便)等特點[3]。近年來，中藥配方顆粒得到了迅速的發(fā)展，但在質(zhì)量工藝、質(zhì)量控制技術(shù)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立等多方面并不完善。筆者曾對6個廠家茜草配方顆粒樣品進(jìn)行質(zhì)量評價，發(fā)現(xiàn)其中大葉茜草素的含量差異顯著(差異高達(dá)10多倍)[4]，且不同廠家的茜草配方顆粒性狀差異明顯，這表明不同廠家采用的生產(chǎn)工藝不盡相同。為此，本研究通過正交試驗對茜草配方顆粒的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)選，以期為工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

盡管有研究用不同濃度的乙醇作為提取溶劑優(yōu)選茜草的提取工藝[5]，但考慮到配方顆粒劑實際工業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)因素以及配方顆粒劑是在傳統(tǒng)湯藥基礎(chǔ)上對中藥飲片改革的一種新形式，因此本文仍采用水作為提取溶劑對茜草配方顆粒的提取工藝進(jìn)行研究。

中藥的成分相對復(fù)雜，其提取工藝的評價如采用單一指標(biāo)進(jìn)行工藝優(yōu)選，則代表性較差，不能保證整體質(zhì)量，故往往采用幾個評判指標(biāo)共同篩選最佳工藝條件。2010年版《中國藥典》以大葉茜草素和羥基茜草素2種成分作為茜草含量測定的檢測指標(biāo)，因此本研究采用梯度洗脫的方法對茜草提取液進(jìn)行分析，同時測定了大葉茜草素和羥基茜草素2種成分的含量。通過對干浸膏得率、大葉茜草素和羥基茜草素提取量等多指標(biāo)進(jìn)行綜合評分，可更為有效地評價茜草的提取工藝，使結(jié)果更具代表性、合理性和全面性。

由于不同類型的評價指標(biāo)其結(jié)果有時不在同一數(shù)量級，直接累加則使數(shù)量級大的對結(jié)果的貢獻(xiàn)大，而小的貢獻(xiàn)小，因此對多指標(biāo)正交試驗評價分析時，需解決指標(biāo)間量綱不一致和相容與否等問題[6]。本研究通過將3個指標(biāo)轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的隸屬度，使不同量綱和數(shù)量級的指標(biāo)數(shù)據(jù)可比化。然后針對各指標(biāo)重要性的差異給出不同的權(quán)重，綜合評分后再進(jìn)行統(tǒng)計分析。在有效成分明確的前提下，浸膏得率越高則有效成分純度越低，應(yīng)減少干浸膏得率的權(quán)重系數(shù)；若指標(biāo)成分不明確，以浸出物多少來代表有效成分時，干浸膏得率的權(quán)重系數(shù)應(yīng)相應(yīng)增大[7]。由于茜草中除含有大葉茜草素和羥基茜草素等醌類物質(zhì)外，還含有萜類、己肽類和多糖等多種物質(zhì)，化學(xué)成分較復(fù)雜，因此本研究適當(dāng)?shù)靥岣吡烁山嗟寐实臋?quán)重系數(shù)，將其定為0.5，而將大葉茜草素和羥基茜草素2種主要成分的權(quán)重系數(shù)各定為0.25，這樣經(jīng)過方差分析優(yōu)選出的工藝條件更加合理。

研究發(fā)現(xiàn)，提取次數(shù)和加水量2個因素對水提工藝有顯著性影響，而提取時間影響較小，但若以正交試驗得分最高的組合(A3B3C2)進(jìn)行實際生產(chǎn)則生產(chǎn)周期長、用水量大，將增加生產(chǎn)成本。在保證提取充分的前提下，從生產(chǎn)實際出發(fā)，筆者適當(dāng)?shù)乜s短了提取時間和減少了加水量。通過驗證試驗，本文優(yōu)選的提取工藝的平均綜合評分達(dá)到0.927分，與A3B3C2組合相比，得分減少約7.3%，但提取時間縮短了1.5 小時，從省時節(jié)能、降低成本的生產(chǎn)實際出發(fā)，確定此條件為最佳提取方案。

參考文獻(xiàn)

[1] 高學(xué)敏.中藥學(xué)[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2006：298.

[2] 李云雁，胡傳榮.實驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理[M].2版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2008：134-136.

[3] 賈曉斌，黃麗霞，陳彥，等.中藥配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)化是臨床療效的基礎(chǔ)[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26(6):1200-1202.

[4] 蔡樂，劉萍，郭桂明，等.不同廠家茜草配方顆粒中大葉茜草素含量的比較[J].北京中醫(yī)藥，2011，30(11):856-858.

[5] 譚朝陽，尤昭玲.茜草提取工藝的研究[J].中草藥，2004，35(4):339-401.

[6] 閆小平，郭宇潔，鄭蕊，等.多指標(biāo)綜合評分法考察腸安Ⅰ號方醇提工藝[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17(4):12-15.

[7] 張彤，徐蓮英，陶建生，等.多指標(biāo)綜合評分法優(yōu)選葛根提取工藝[J].中草藥，2004，35(1):38-40.