洛伐他汀自組裝前體脂質(zhì)體的制備及其理化性質(zhì)的研究

孫川棣，劉建平

中國(guó)藥科大學(xué)藥劑研究所，南京 210009

他汀類（statins）藥物是目前國(guó)內(nèi)外研究最多也最具前途的降血脂藥物。目前臨床較常用的他汀類藥物有：洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀等。其中辛伐他?。╯imvastatin）由美國(guó)默克公司開(kāi)發(fā)，1991年獲美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)[1]。普伐他?。╬ravastatin）由日本三共株式會(huì)社研究成功后于1989年率先在日本上市。洛伐他?。╨ovastatin）是第一個(gè)獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市的他汀類藥物,它主要用于治療原發(fā)性高膽固醇血癥和以高膽固醇異常為主的高脂血癥，還可防治冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、延緩硬化進(jìn)程，并減少梗塞病的發(fā)生。其獨(dú)特的療效，被譽(yù)為治療心血管系統(tǒng)疾病的里程碑，深受廣大患者的歡迎[2]。

目前臨床上使用的洛伐他汀以片劑和膠囊劑等口服制劑為主，如Merck公司的系列產(chǎn)品[3-5]Lovalip?、Mevacor?、Mevinacor?、Mevlor?以及 Sidus公司的Sivlor?。國(guó)內(nèi)也研制了洛伐他汀的普通片，主要品種有羅華寧?、美降脂?、美降之?等，其他上市的還有滴丸、緩釋片、膠囊[6]。但由于其水溶性差，口服吸收率僅為31%，存在肝首過(guò)效應(yīng)[7]，體內(nèi)消除半衰期僅為3 h左右，屬于短半衰期藥物，口服生物利用度低，有胃腸道不適、腹瀉、脹氣等常見(jiàn)不良反應(yīng)[8]，這些給預(yù)防用藥的患者和大多數(shù)慢性心血管病患者帶來(lái)了諸多不便。

脂質(zhì)體作為新型的載體給藥系統(tǒng)，具有生物膜特性和藥物傳輸能力，將難溶性藥物包裹在脂質(zhì)雙分子層中，使其具有較強(qiáng)的兩親性,可以顯著提高藥物的口服跨膜吸收率及體內(nèi)生物利用度[9-10]。本研究以洛伐他汀為模型藥物，制成洛伐他汀自組裝前體脂質(zhì)體（self-assemble proliposomes），克服了普通脂質(zhì)體在貯存期間易發(fā)生聚集、融合及藥物滲漏等穩(wěn)定性問(wèn)題；同時(shí)，洛伐他汀自組裝前體脂質(zhì)體制備工藝簡(jiǎn)單，易于擴(kuò)大化生產(chǎn)，省去了固體型前體脂質(zhì)體除去有機(jī)溶劑的步驟，解決了其水合過(guò)程中存在的水合速度較慢、分散不均勻等問(wèn)題。目前尚未見(jiàn)洛伐他汀脂質(zhì)體口服制劑報(bào)道，此研究為提高洛伐他汀的生物利用度，開(kāi)發(fā)口服洛伐他汀脂質(zhì)體制劑，使其更好地發(fā)揮臨床療效奠定了基礎(chǔ)。

1 試劑與儀器

洛伐他?。〒P(yáng)子江藥業(yè)惠贈(zèng)）；洛伐他汀對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào)：100600-200502）；大豆磷脂(上海太偉藥業(yè)有限公司，批號(hào)：100819)；膽固醇（Sigma 公司，批號(hào)：MKBD9096V）；去氧膽酸鈉 （國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)：F20100607）；Sephadex G-50（Pharmacia 進(jìn)口分裝）。PEG400（西隴化工股份有限公司，CP）；無(wú)水乙醇（南京化學(xué)試劑有限公司，分析純）。

UV-2000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海尤尼柯儀器有限公司）；日立H-7650透射電鏡（日本日立公司）；Zetasizer 3000HSA粒徑測(cè)定儀 （英國(guó)Malvern公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 洛伐他汀自組裝前體脂質(zhì)體的制備

大豆磷脂為膜材,無(wú)水乙醇、PEG-400為分散介質(zhì)，將處方量洛伐他汀直接溶解于含有大豆磷脂、PEG-400的無(wú)水乙醇溶液中，再加入適量修飾劑A（即伯洛沙姆）、膽固醇、去氧膽酸鈉，溶解制成前體脂質(zhì)體澄明溶液后，以0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即制成洛伐他汀自組裝前體脂質(zhì)體。取洛伐他汀前體脂質(zhì)體少量，加入水合介質(zhì)振搖得白色混懸液，即得到洛伐他汀脂質(zhì)體。

2.2 洛伐他汀的分光光度分析方法

精密稱取干燥至恒重的洛伐他汀適量于量瓶中，經(jīng)無(wú)水乙醇定容后稀釋到質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1的儲(chǔ)備液。精密吸取儲(chǔ)備液適量至10 mL量瓶中，分別用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻得濃度為2、4、8、12、16 μg·mL-1的洛伐他汀溶液，以無(wú)水乙醇空白作對(duì)照，分別于238 nm處測(cè)定吸收度值，以濃度（C）對(duì)吸收度值（A）線性回歸得標(biāo)準(zhǔn)方程。洛伐他汀含量的線性回歸方程為：C=16.01A+0.1726，r=0.9999，線性范圍：4～16 μg·mL-1。 高、中、低 3 個(gè)濃度的平均回收率分別為99.92%、99.54%及99.59%,日內(nèi)及日間精密度RSD均＜2%,均符合要求。因在238 nm處輔料對(duì)藥物測(cè)定有干擾，每次測(cè)定需制備空白脂質(zhì)體用無(wú)水乙醇定容并測(cè)定吸收值，從總吸收值中扣除輔料的吸收值[11]。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)處方篩選

采用正交試驗(yàn)篩選前體脂質(zhì)體的處方，選擇藥物∶磷脂（A，1∶20、1∶18、1∶15）、磷脂∶修飾劑 A（B，3∶1、2.5∶1、2∶1）、 磷脂∶膽固醇 （C，20∶1、10∶1、5∶1）3 個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，以水合后的包封率為指標(biāo)，用L9（34）正交試驗(yàn)表研究輔料用量對(duì)前體脂質(zhì)體物理特性的影響，篩選和優(yōu)化前體脂質(zhì)體的處方。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各因素主次順序?yàn)椋篊＞B＞A，最優(yōu)方案是 A2B1C1。故最優(yōu)處方為：藥物∶磷脂為 1∶18，磷脂∶修飾劑 A 為 3∶1，磷脂∶膽固醇為 20∶1。

2.4 脂質(zhì)體的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.4.1 脂質(zhì)體形態(tài)取洛伐他汀前體脂質(zhì)體分別用蒸餾水和人工胃液水合，所得脂質(zhì)體混懸液滴至專用覆蓋碳膜銅網(wǎng)上，靜置5 min，用2.0%磷鎢酸鈉負(fù)染液染色，室溫自然晾干，然后用日立H-7650透射電鏡觀察。結(jié)果如圖1所示，A圖和B圖中都可見(jiàn)脂質(zhì)體為圓球或近圓球形，且具有明顯的指紋特征，說(shuō)明洛伐他汀前體脂質(zhì)體在水中和人工胃液中都能成功自組裝成為脂質(zhì)體。

圖1 洛伐他汀脂質(zhì)體透射電鏡圖

2.4.2 粒徑和Zeta電位取水合后脂質(zhì)體混懸液用蒸餾水適當(dāng)稀釋，用Zetasizer 3000HS激光粒度儀測(cè)定粒徑和Zeta電位。結(jié)果表明，洛伐他汀脂質(zhì)體的平均粒徑為 （327.4±29.6）nm，多分散系數(shù)為0.447±0.102，Zeta電位為-（22.40±1.5）mV， 表明脂質(zhì)體粒子表面荷負(fù)電，在一定程度上阻止了粒子聚結(jié)，從而保證了脂質(zhì)體混懸液的物理穩(wěn)定性。

2.4.3 微柱離心法測(cè)定洛伐他汀脂質(zhì)體的包封率

2.4.3.1 洗脫曲線 采用微柱離心法分離脂質(zhì)體與游離藥物，取5 mL塑料注射器，去芯，底部塞入脫脂棉，裝入預(yù)先用蒸餾水浸泡的葡聚糖凝膠，柱高約 5 cm，1000 r·min-1離心 2 min除去過(guò)量的蒸餾水，得到葡聚糖凝膠微柱。

精密吸取水合的洛伐他汀脂質(zhì)體0.4 mL，緩緩加于柱頂部，1000 r·min-1離心2 min收集濾液，再于柱頂部加入相同體積的蒸餾水，相同條件下離心，重復(fù)上述操作，分別收集每次離心所得的濾液，用無(wú)水乙醇定容至10 mL，測(cè)定吸收度后計(jì)算藥物濃度，繪制洗脫曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，脂質(zhì)體在前2 mL洗脫完畢，游離藥物后被洗脫下來(lái)，脂質(zhì)體和游離藥物分離良好。

圖2 洛伐他汀脂質(zhì)體包封率測(cè)定的洗脫曲線

2.4.3.2 包封率測(cè)定 按“2.4.3.1”項(xiàng)下制備葡聚糖凝膠微柱，取水合的洛伐他汀脂質(zhì)體0.4 mL緩慢滴加到柱床上，將微柱放入干凈的離心管中，1000 r·min-1離心2 min，連續(xù)洗脫3次，合并所收集的濾液，無(wú)水乙醇定容后測(cè)定吸收度，計(jì)算得到已包封藥物濃度 （C1）；另取水合后的洛伐他汀脂質(zhì)體0.4 mL，加入無(wú)水乙醇定容，檢測(cè)總藥物濃度（C0）；包封率（E）=C1/C0×100%。3批樣品中洛伐他汀的平均包封率為95.4%±6.7%。

2.4.4 洛伐他汀脂質(zhì)體的自組裝速度的測(cè)定類脂在水性介質(zhì)中所形成膠體溶液的分散程度可通過(guò)測(cè)定其濁度（τ）的變化來(lái)評(píng)價(jià)，當(dāng)類脂在水性介質(zhì)中分散形成均一體系時(shí)，體系的濁度幾乎達(dá)到坪值，不再發(fā)生明顯的變化。由于膠體溶液的濁度（τ）與其吸光度（A）呈正相關(guān)[12]，因此可通過(guò)測(cè)定洛伐他汀前體脂質(zhì)體自組裝過(guò)程中吸收度的變化來(lái)評(píng)價(jià)其自組裝的速度和程度。具體方法為：使用人工胃液配對(duì)，在樣品池中加入3 mL人工胃液，用微量進(jìn)樣針在液面下快速注入前體脂質(zhì)體，反復(fù)振搖，在600 nm處快速測(cè)定吸收度，每份樣品測(cè)定3次，最高點(diǎn)時(shí)間和穩(wěn)定時(shí)間的吸收度取平均值，以此考察洛伐他汀前體脂質(zhì)體在水合介質(zhì)中的自組裝速度，結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3可見(jiàn)，吸收度在60 s左右不再變化，說(shuō)明洛伐他汀自組裝前體脂質(zhì)體在60 s內(nèi)形成脂質(zhì)體，并達(dá)到分散平衡。

圖3 洛伐他汀前體脂質(zhì)體自組裝速度

2.4.5 滲漏穩(wěn)定性分別取洛伐他汀前體脂質(zhì)體于不同量人工胃液中水合形成不同稀釋倍數(shù)的洛伐他汀脂質(zhì)體溶液（50倍、100倍），并將此脂質(zhì)體于 4℃放置 0、2、4、6、8、12 h 后測(cè)定包封率，以放置后的藥物包封率與初制備時(shí)的包封率相比，考察脂質(zhì)體滲漏率。結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，與0 h相比，洛伐他汀脂質(zhì)體在4℃放置12 h后，包封率變化不大，說(shuō)明藥物滲漏較少，脂質(zhì)體較穩(wěn)定。

表1 洛伐他汀脂質(zhì)體的滲漏穩(wěn)定性

2.4.6 粒徑穩(wěn)定性取一定量的洛伐他汀自組裝前體脂質(zhì)體注入人工胃液中形成自組裝洛伐他汀脂質(zhì)體，于 0、1、2、3、4、5、6、8、12 h 測(cè)定粒徑大小，以不同時(shí)間點(diǎn)的粒徑大小對(duì)時(shí)間作圖，評(píng)價(jià)洛伐他汀脂質(zhì)體在水合介質(zhì)中的粒徑穩(wěn)定性。由圖4可見(jiàn)，不同時(shí)間水合后，脂質(zhì)體粒子粒徑變化不大，預(yù)示前體脂質(zhì)體進(jìn)入體內(nèi)后同水分逐漸接觸的過(guò)程中，脂質(zhì)體粒子不會(huì)發(fā)生聚結(jié)、融合。

圖4 洛伐他汀脂質(zhì)體的粒徑穩(wěn)定性

3 討 論

前體脂質(zhì)體在一定程度上克服了傳統(tǒng)脂質(zhì)體易聚集、融合及藥物滲漏等不穩(wěn)定問(wèn)題，但在制備固體型前體脂質(zhì)體過(guò)程中，因其工藝復(fù)雜，成本高，難以用于臨床，且固體型前體脂質(zhì)體水合過(guò)程也存在水合速度較慢、局部溶解不完全、分散不均勻等問(wèn)題，從而導(dǎo)致藥物包封率和粒徑等主要質(zhì)量指標(biāo)不易有效控制，故難以滿足臨床使用要求，至今尚無(wú)該類制劑上市。本文采用一種新型前體脂質(zhì)體制備方法，此法簡(jiǎn)便易行，在水合過(guò)程中不必采用勻化技術(shù)或機(jī)械，即可快速自組裝成為包封率高的含藥脂質(zhì)體，同時(shí)避免了以往固體型前體脂質(zhì)體制備中有機(jī)溶媒的去除過(guò)程。本法制備的自組裝前體脂質(zhì)體在貯存過(guò)程中為無(wú)水狀態(tài)的澄明液體，是一種動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定體系,有效解決了脂質(zhì)體的穩(wěn)定性問(wèn)題，這為脂質(zhì)體真正走向市場(chǎng)開(kāi)拓了新途徑。

采用本文的前體脂質(zhì)體制備方法得到的洛伐他汀前體脂質(zhì)體可快速自組裝形成含藥脂質(zhì)體，且脂質(zhì)體包封率較高。滲漏和粒徑穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明脂質(zhì)體具有良好穩(wěn)定性。

本文將洛伐他汀制成新型前體脂質(zhì)體，并初步考察了制備洛伐他汀前體脂質(zhì)體的可行性。洛伐他汀前體脂質(zhì)體的體內(nèi)動(dòng)力學(xué)特征、分布、代謝等情況，仍需進(jìn)一步考察。

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