誘導(dǎo)11β-HSD1表達(dá)對(duì)GC保護(hù)血管內(nèi)皮炎性損傷作用的影響

王興友 王麗娜 陳曉琳 陳杭薇

根據(jù)我們前期研究，初步表明糖皮質(zhì)激素(GC)能有效保護(hù)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮炎性損傷［1］。鑒于11β-HSD是目前公認(rèn)的GC受體前調(diào)節(jié)的關(guān)鍵物質(zhì)，其兩型同工酶11β-HSD1和11β-HSD2在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中均有組成性表達(dá)，同時(shí)我們前面的實(shí)驗(yàn)表明內(nèi)毒素和糖皮質(zhì)激素對(duì)11β-HSD的表達(dá)均有影響［2］。因此通過(guò)干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的11β-HSD表達(dá)，必定會(huì)對(duì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)有所影響。甘草次酸(glycyrrhizic acid，GA)作為11β-HSD的傳統(tǒng)抑制劑，在其他組織細(xì)胞對(duì)11β-HSD表達(dá)影響的研究已有很多報(bào)道，有研究表明應(yīng)用甘草次酸類藥物，可抑制嗜酸細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白與氣道上皮細(xì)胞的結(jié)合從而減輕氣道炎癥［3］。但目前有關(guān)其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞11β-HSD影響的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，鑒于11β-HSD1可增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)GC的活性，而11β-HSD2則降低細(xì)胞內(nèi)GC的活性。因此我們推測(cè)，甘草次酸的抗炎作用既與抑制11β-HSD2表達(dá)有關(guān)，也與增強(qiáng)11β-HSD1表達(dá)有關(guān)。我們已初步證實(shí)甘草次酸對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞11β-HSD2表達(dá)的抑制可增強(qiáng)GC的抗炎作用(將另文發(fā)表)，本實(shí)驗(yàn)擬觀察甘草次酸(GA)能否誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞11β-HSD1表達(dá)，從而增強(qiáng)GC的抗炎作用。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料:(1)主要儀器:PCR擴(kuò)增儀，Lambda Bio20紫外分光光度計(jì)，AlphaImagerTM2200型凝膠成像儀，臺(tái)式冷凍離心機(jī)，Power AC電泳儀，金屬浴。(2)主要試劑:總RNA提取試劑盒，AMV反轉(zhuǎn)錄酶，Taq DNA聚合酶，Oligo(dT)15，dNTP，RNA酶抑制劑，DNA marker，甘草次酸，脂多糖，糖皮質(zhì)激素，ELISA試劑盒。

2.實(shí)驗(yàn)方法:(1)細(xì)胞分組及處理:1)GA對(duì)單純血管內(nèi)皮細(xì)胞11β-HSD1表達(dá)的影響:為了觀察不同濃度GA對(duì)11β -HSD1 的基因轉(zhuǎn)錄的影響，用 10-8、10-7、10-6、10-5、10-3mol/L的GA分別與血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)24h，不接觸GA的細(xì)胞作對(duì)照;2)GA對(duì)炎性損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞的效應(yīng)觀察:①LPS致傷組:在培養(yǎng)細(xì)胞中加入100ng/ml的LPS“致傷”24h;②GA保護(hù)組:先加10-6mol/L GA 2h后，再用100ng/ml的LPS處理細(xì)胞24h;③GA-GC復(fù)合組:在培養(yǎng)細(xì)胞中先后加入10-6mol/L GA和Dex 2h后，再用100ng/ml的LPS處理細(xì)胞24h;④GC保護(hù)組:不加GA，在培養(yǎng)細(xì)胞中先后加入10-6mol/L Dex 2h后，再用100ng/ml的LPS處理細(xì)胞24h;⑤單純GA組:在培養(yǎng)細(xì)胞中先后加入10-6mol/L GA后，再繼續(xù)培養(yǎng)24h;⑥空白對(duì)照組:不用GA、LPS和Dex的正常培養(yǎng)細(xì)胞作正常對(duì)照。上述各組觀察時(shí)相到后分別搜集細(xì)胞和培養(yǎng)上清進(jìn)行有關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。(2)HUVEC內(nèi)11β-HSD1的mRNA表達(dá)的檢測(cè):11β-HSD1引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成，各基因引物序列見(jiàn)表 1［4，5］。然后按 RT-PCR常規(guī)合成相應(yīng)的PCR產(chǎn)物，將電泳圖像保存于計(jì)算機(jī)用Bandscan軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)11β-HSD1的mRNA與β-actin mRNA的灰度比值。(3)IL-6和sICAM-1的檢測(cè):參照文獻(xiàn)［1］進(jìn)行。(4)HUVEC原位細(xì)胞凋亡的檢測(cè):參照文獻(xiàn)［1］進(jìn)行。

表1 PCR引物的序列及其產(chǎn)物長(zhǎng)度

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:使用SPSS 11.0軟件包進(jìn)行，全部數(shù)據(jù)都以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間差異用方差分析，組內(nèi)差異比較采用t檢驗(yàn)。結(jié)果百分率采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，用二變量(Bivariate)Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析。以P＜0.05為差異顯著，P＜0.01表示差異具有非常顯著性意義。

結(jié) 果

1.GA對(duì)HUVEC11β-HSD1的mRNA表達(dá)的影響:(1)GA對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞11β-HSD1 mRNA的影響:在正常培養(yǎng)的細(xì)胞可檢測(cè)到較少量的11β-HSD1 mRNA，甘草次酸在一定劑量范圍(10-8～10-3mol/L)與細(xì)胞血管內(nèi)皮共培養(yǎng)24h，可引起11β-HSD1 mRNA明顯增加，并隨著劑量的增高，逐漸形成平臺(tái)(表2)。(2)GA對(duì)地塞米松和 LPS誘導(dǎo)11β-HSD1 mRNA表達(dá)的影響:GA本身能明顯誘導(dǎo)11β-HSD1 mRNA的表達(dá)，GA對(duì)Dex誘導(dǎo)的11β-HSD1 mRNA表達(dá)有促進(jìn)作用，而對(duì) LPS誘導(dǎo)的11β-HSD1 mRNA表達(dá)則沒(méi)有促進(jìn)作用，詳見(jiàn)表3。

表2 GA對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞11β-HSD1 mRNA的影響(±s)

表2 GA對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞11β-HSD1 mRNA的影響(±s)

與對(duì)照組相比，*P＜0.05;與低劑量組相比，△P＜0.05;與大劑量、超高劑量組相比，#P＜0.05

組別 GA濃度(mol/L)11β-HSD1 mRNA/β-actin mRNA對(duì)照組00.03±0.004低劑量組 10-8 0.04±0.005常規(guī)劑量組 10-7 0.08±0.002*大劑量組 10-6 0.16±0.02＊△高劑量組 10-5 0.26±0.04＊△#超高劑量組 10-3 0.31±0.07＊△

表3 大劑量GA(濃度為10-6mol/L)對(duì)HUVEC的11β-HSD1 mRNA表達(dá)的影響(±s)

表3 大劑量GA(濃度為10-6mol/L)對(duì)HUVEC的11β-HSD1 mRNA表達(dá)的影響(±s)

與單純GA組比，*P＜0.05;與GC保護(hù)組比，△P＜0.05;與空白對(duì)照組比，#P＜0.01;與GA保護(hù)組及LPS致傷組比，▲P＞0.05

組別 11β -HSD1 mRNA/β-actin mRNA空白對(duì)照組0.03±0.004 LPS致傷組 0.38±0.06 GA保護(hù)組 0.41±0.07*GA-GC復(fù)合組 0.42±0.09＊△▲GC保護(hù)組 0.28±0.03單純GA組 0.16±0.02#

2.GA對(duì)HUVEC分泌IL-6和sICAM-1的影響:在LPS的刺激下，HUVEC分泌IL-6和sICAM-1的量明顯增多。而GA和Dex均能抑制二者的分泌，GA與Dex合用可顯著抑制IL-6和sICAM-1的分泌。具體見(jiàn)表4。

表4 大劑量GA(濃度為10-6mol/L)對(duì)HUVEC的IL-6和sICAM-1分泌的影響(± s，pg/ml)

表4 大劑量GA(濃度為10-6mol/L)對(duì)HUVEC的IL-6和sICAM-1分泌的影響(± s，pg/ml)

與致傷組比，*P＜0.05，△P＜0.01

組別 IL-6含量 sICAM-1含量空白對(duì)照組63.2±6.3 23.2±2.7 LPS致傷組 606.1±17.3 516.8±15.1 GA保護(hù)組 436.2±11.8* 383.2±6.3*GA-GC復(fù)合組 168.6±21.9△ 26.3±2.9 GC保護(hù)組 66.3±5.1 216.5±12.2△單純GA組 286.5±11.3△ 156.3±11.3△

3.GA對(duì)HUVEC發(fā)生原位凋亡的影響:GA和Dex均能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，二者合用表觀上增加了對(duì)HUVEC凋亡的抑制效應(yīng)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上與單獨(dú)應(yīng)用Dex的作用并無(wú)差異，具體見(jiàn)表5。

表5 大劑量GA(濃度為10-6mol/L)對(duì)HUVEC的發(fā)生凋亡的影響( ± s，%)

與LPS致傷組比，*P＜0.01，△P＜0.05;與GA保護(hù)組比，#P＜0.05;與GC保護(hù)組比，▲P＞0.05

組別 細(xì)胞凋亡率空白對(duì)照組1.2±0.4 LPS致傷組 36.7±3.9 GA保護(hù)組 23.5±1.7△GA-GC復(fù)合組 12.6±0.6＊▲#GC保護(hù)組 13.2±0.9*單純GA組1.6±0.3

討 論

甘草次酸具有抗炎、抗過(guò)敏、鎮(zhèn)咳、平喘及祛痰等廣泛的藥理作用，其中抗炎、抗過(guò)敏、平喘的作用與糖皮質(zhì)激素相似。但至今GA與GC的內(nèi)在關(guān)系缺乏深入研究，探討二者的關(guān)系將有助于進(jìn)一步揭示和深化GC的抗炎作用機(jī)制，為臨床合理應(yīng)用GC提供新的思路。以往研究中，甘草次酸已被視為經(jīng)典的11β-羥基類固醇脫氫酶的抑制劑。有關(guān)GA與11β-羥基類固醇脫氫酶的研究主要涉及其不良反應(yīng)的產(chǎn)生機(jī)制，比如臨床應(yīng)用該藥常伴有的假醛固酮增多癥(pseudoaldosteronism)就認(rèn)為與GA對(duì)11β-羥基類固醇脫氫酶的抑制有關(guān)［6］。但有關(guān)GA通過(guò)如何調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的11β-羥基類固醇脫氫酶，進(jìn)而參與炎癥調(diào)控的研究，迄今未見(jiàn)報(bào)道。

長(zhǎng)期以來(lái)認(rèn)為GA發(fā)揮抗炎作用與阿司匹林相似，但與地塞米松不同。GA抗炎機(jī)制被認(rèn)為與抑制脂氧酶和環(huán)氧酶，進(jìn)而抑制 LTC4、LTD4、LTE4及PGE2等炎性介質(zhì)的生成有關(guān)。但近年認(rèn)為與調(diào)節(jié)T細(xì)胞分泌IL-5等細(xì)胞因子有關(guān)［7］。在本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到GA能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的HUVEC分泌IL-6和sICAM-1，同時(shí)顯著降低LPS誘導(dǎo)的HUVEC的細(xì)胞凋亡率。因此筆者認(rèn)為抑制IL-6等前炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減少血管內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞的黏附，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷也是GA的一個(gè)抗炎機(jī)制。鑒于11β-HSD是GC作用的受體前調(diào)節(jié)的關(guān)鍵物質(zhì)，GA又是傳統(tǒng)的11β-HSD抑制劑，但在本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到GA并沒(méi)有對(duì)11β-HSD1的表達(dá)進(jìn)行抑制，相反卻能誘導(dǎo)11β-HSD1的表達(dá)，故我們推測(cè)GA主要對(duì)11β-HSD2表達(dá)起抑制作用，而對(duì)11β-HSD1則主要起誘導(dǎo)作用，也許GA對(duì)11β-HSD的這種雙向作用，正是其發(fā)揮抗炎作用的根本途徑。因此11β-HSD1完全可以作為GA抗炎等作用的一個(gè)靶點(diǎn)。GA與GC合用所增強(qiáng)的抗炎效應(yīng)與11β-HSD的表達(dá)情況必定會(huì)有聯(lián)系。

近年來(lái)抑制11β-HSD1的研究主要是關(guān)于代謝疾病，例如肥胖和糖尿病［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，GA單獨(dú)作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，能夠上調(diào) 11β-HSD1mRNA的表達(dá)。GA與GC(Dex)合用也可促進(jìn)11β-HSD1mRNA的表達(dá)。同時(shí)加強(qiáng)了GC對(duì)LPS誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的抑制作用及炎性細(xì)胞因子IL-6、sICAM-1分泌的抑制作用，對(duì)GA對(duì)炎癥的影響有一定意義。

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