腦出血患者抵抗素基因+299G＞A 位點(diǎn)多態(tài)性分析

董曉巧 杜 權(quán) 俞文華 張祖勇 陳 雋 翁建豐 朱 強(qiáng) 車志豪

腦出血發(fā)病率高，預(yù)后差［1，2］。炎癥反應(yīng)參與腦出血后繼發(fā)性腦損傷［3，4］。抵抗素是一種首先發(fā)現(xiàn)由白色脂肪細(xì)胞分泌的肽類激素，可表達(dá)于腦外傷及腦缺血?jiǎng)游锬X皮質(zhì)，參與炎癥反應(yīng)［5～8］。我們最近研究發(fā)現(xiàn)，腦出血患者血漿抵抗素水平升高，且與預(yù)后顯著相關(guān)［9］。抵抗素基因內(nèi)含子2區(qū)+299G＞A位點(diǎn)A等位基因的存在可以增加血液及組織中抵抗素的表達(dá)，從而影響其生物學(xué)效應(yīng)，但其與腦出血相關(guān)研究少見報(bào)道［10，11］。本研究運(yùn)用限制性內(nèi)切酶方法，對(duì)抵抗素基因+299G＞A位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析，旨在揭示抵抗素基因+299G＞A位點(diǎn)多態(tài)性與腦出血炎癥反應(yīng)的相關(guān)性，為腦出血繼發(fā)性腦損傷研究提供遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

資料與方法

1．一般資料:腦出血病例為2007年1月～2009年12月杭州市第一人民醫(yī)院和慈溪市第二人民醫(yī)院神經(jīng)外科收治的高血壓性基底節(jié)出血患者，共344例。對(duì)照組為同期杭州市第一人民醫(yī)院健康體檢者，共344例，年齡及性別均與腦出血病例配對(duì)。腦出血患者一般情況及臨床資料詳見表1。腦出血患者和對(duì)照組均除外既往腦卒中、使用抗凝劑、嚴(yán)重感染、嚴(yán)重心肝腎疾病及嚴(yán)重頭部外傷史。

2．指標(biāo)測(cè)定:腦出血患者和對(duì)照組靜脈血在入院時(shí)或體檢時(shí)獲得。腦出血患者血標(biāo)本立即放入無菌EDTA試管中，在4℃、1500r/min、離心20min收集血漿，儲(chǔ)存在 －70℃環(huán)境中待檢。ELISA法測(cè)定血漿抵抗素和C－反應(yīng)蛋白濃度，試劑購于美國R＆D systems公司。

3．抵抗素基因+299G＞A位點(diǎn)多態(tài)性分析:使用美國Stratagene公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒提取腦出血患者及對(duì)照組外周血DNA，利用PCR－RFLP法分析抵抗素基因 +299G＞A位點(diǎn)基因多態(tài)性。根據(jù)人抵抗素基因特異序列設(shè)計(jì)引物:上游引物 5'－GGAAGAAGCCATCAATGAGAGG －3'，下游引物5'－CCTGTTGGTTTGGAGCTAGGTC－3'，擴(kuò)增片段長度352bp，由上海生物工程有限公司合成。PCR擴(kuò)增試劑盒為美國 MBI fermentas 公司生產(chǎn)，共 20μl，含 0．1mmol/L dNTP、1 U Taq DNA 聚合酶、MgCl22mmol/L、上下游引物各 0．25μmol/L、DNA模版約200ng。PCR反應(yīng)條件:95℃ 變性7min，64℃退火1min，72℃延伸2min，共循環(huán)35次，末次循環(huán)后72℃再延伸10min。取擴(kuò)增產(chǎn)物3μl，用限制性內(nèi)切酶AluⅠ酶(為美國NEB公司)5U對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在37℃下酶切12h。將酶切產(chǎn)物點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠電泳，紫外線燈下觀察結(jié)果、攝片，分析基因型。

4．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 10．0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料行正態(tài)檢驗(yàn)，正態(tài)分布數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±+s)表示，行方差分析，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)(上四分位數(shù)，下四分位數(shù))表示，行Kruskal－Wallis H test檢驗(yàn)，分類資料比較和Hardy－Weinberg平衡行卡方檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)相關(guān)性行Spearman相關(guān)分析和多元線性回歸分析，P＜0．05定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．抵抗素基因 +299G＞A位點(diǎn)多態(tài)性分析:腦出血患者及對(duì)照組PCR產(chǎn)物均可見預(yù)期的352bp的片段。經(jīng)限制性內(nèi)切酶AluⅠ對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切后產(chǎn)物電泳共獲得GG、GA和AA 3種基因型。對(duì)照組等位基因 G和 A的頻率分別為64．8%和35.2%，基因型GG、GA和AA的頻率依次為41.9%、45．9%和12．2%。腦出血患者等位基因G和A的頻率分別為69．3%和30．7%，基因型GG、GA和AA的頻率依次為49．1%、40．4% 和10．5%。經(jīng) Hardy－Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)，腦出血患者及對(duì)照組各基因型頻率均已達(dá)遺傳平衡，具有群體代表性。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，腦出血患者及對(duì)照組各基因型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0．159)。

2．抵抗素基因 +299G＞A位點(diǎn)多態(tài)性與血漿抵抗素和C－反應(yīng)蛋白水平的相關(guān)性分析:經(jīng)方差分析，GG基因型患者血漿抵抗素均顯著低于GA和AA基因型患者(P=0．003，P=0．027)，而 GA 和 AA 基因型患者血漿抵抗素濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.714);GG基因型患者血漿C－反應(yīng)蛋白濃度均顯著低于 GA和 AA基因型患者(P=0．002，P=0.024)，而GA和AA基因型患者血漿C－反應(yīng)蛋白濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0．766)(表1)。

3．血漿C－反應(yīng)蛋白與抵抗素濃度的相關(guān)分析:Spearman相關(guān)分析顯示，血漿C－反應(yīng)蛋白濃度與血漿抵抗素濃度(r=0．514，P ＜0．001)、格拉斯哥評(píng)分(r= － 0．425，P ＜ 0．001)、血糖(r=0．282，P ＜0.001)、血腫體積(r=0．397，P ＜0．001)、血肌酐激酶(r=0．118，P=0．028)、血纖維蛋白原(r=0．275，P ＜0．001)和 D － 二聚體(r=0．294，P ＜0．001)均呈顯著相關(guān)性。多元線性回歸分析顯示，血漿C－反應(yīng)蛋白濃度與血漿抵抗素濃度(t=7．032，P＜0．001)和格拉斯哥評(píng)分(t= －4．845，P＜0．001)仍顯著相關(guān)性。

表1 腦出血患者+299G＞A基因型之間腦出血相關(guān)指標(biāo)的比較

討 論

腦出血后繼發(fā)性腦損傷的病理生理機(jī)制復(fù)雜，涉及很多方面。炎癥反應(yīng)是腦出血后繼發(fā)性腦損傷的重要組成部分。腦出血后，補(bǔ)體、凝血酶和纖維蛋白降解產(chǎn)物等可誘發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，從而白介素－6、白介素－10、腫瘤壞死－α等許多炎癥因子濃度升高，血腦屏障通透性增加，腦水腫加重，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡，加重腦損傷［3，4］。

抵抗素是一種主要由白色脂肪細(xì)胞分泌的肽類激素，與Ⅱ型糖尿病、胰島素抵抗、高血壓、肥胖、脂質(zhì)代謝異常等有關(guān)［12～14］。近年來研究表明抵抗素在外周血單核細(xì)胞中高表達(dá)，并與多個(gè)炎性標(biāo)志物相關(guān)，提示抵抗素是一種前炎性細(xì)胞因子，可能以一種代謝信號(hào)的方式表達(dá)潛在的炎性作用，引起多系統(tǒng)炎性相關(guān)性疾病［5，6，12～14］。在小鼠缺血腦損傷中，損傷同側(cè)大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)抵抗素表達(dá)明顯增加［7］。在大鼠創(chuàng)傷性腦損傷中，損傷同側(cè)和對(duì)側(cè)海馬區(qū)抵抗素mRNA水平顯著增加［8］。我們研究發(fā)現(xiàn)，腦外傷及腦出血患者血漿抵抗素水平升高，且與預(yù)后顯著相關(guān)［9，15］。最近研究發(fā)現(xiàn)，腦外傷患者血漿抵抗素濃度和超敏C－反應(yīng)蛋白顯著相關(guān)。本研究亦發(fā)現(xiàn)，血漿抵抗素濃度與C－反應(yīng)蛋白濃度顯著相關(guān)。這些提示，抵抗素在腦損傷后炎癥反應(yīng)中具有重要角色。

人抵抗素基因定位于19p13．2，其mRNA含476個(gè)堿基對(duì)，其編碼區(qū)含有326個(gè)堿基對(duì)，編碼108個(gè)氨基酸。國內(nèi)外學(xué)者通過基因篩查發(fā)現(xiàn)抵抗素有30個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中內(nèi)含子區(qū)17個(gè)，啟動(dòng)子區(qū)5個(gè)，外顯子區(qū)8個(gè)，其中抵抗素基因內(nèi)含子2區(qū) +299G＞A位點(diǎn)多態(tài)性可以影響血液及組織中抵抗素的表達(dá)，從而影響其生物學(xué)效應(yīng)，血清抵抗素水平在AA基因型表達(dá)最高，其次 GA 型，GG 型表達(dá)最少［10，11］。抵抗素+299G＞A基因多態(tài)性可能與2型糖尿病易感性相關(guān)［11］。本研究發(fā)現(xiàn)抵抗素基因+299G＞A位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與腦出血無顯著相關(guān)性。同時(shí)，本研究腦出血患者各基因型組間一般資料、臨床資料及常規(guī)化驗(yàn)結(jié)果等混淆因素差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)而分析發(fā)現(xiàn)抵抗素基因+299G＞A位點(diǎn)多態(tài)性與腦出血患者血漿抵抗素濃度顯著相關(guān)。有趣的是，我們也發(fā)現(xiàn)抵抗素基因+299G＞A位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與腦出血患者血漿C－反應(yīng)蛋白濃度顯著相關(guān)。這些提示，抵抗素基因+299G＞A位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性可能參與腦出血后的炎癥反應(yīng)。

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