應(yīng)用藥物溶出/吸收仿生系統(tǒng)研究三七總皂苷與冰片的配伍規(guī)律*

顧 慧 ，馬葉濤 ，尋明金，時曉燕 ，何 新 ，2

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 300193；2.天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津 300193）

應(yīng)用藥物溶出/吸收仿生系統(tǒng)研究三七總皂苷與冰片的配伍規(guī)律*

顧 慧1，馬葉濤1，尋明金1，時曉燕1，何 新1，2

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 300193；2.天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津 300193）

[目的]以三七總皂苷（PNS）中3種主要活性成分人參皂苷Rg1（Rg1）、人參皂苷Rb1（Rb1）和三七皂苷R1（R1）為質(zhì)控成分，應(yīng)用藥物溶出/吸收仿生系統(tǒng)（DDAS S）研究PNS與冰片配伍前后的腸透過規(guī)律，并探討其吸收機制，以期將該系統(tǒng)用于創(chuàng)新中藥開發(fā)和處方篩選，為傳統(tǒng)中藥研究提供新的方法。[方法]建立同時測定PNS中Rg1、Rb1和R1的高效液相色譜（HPLC）方法；應(yīng)用DDASS法，考察PNS與冰片配伍前后3種成分的腸累積透過量（Qt）及表觀滲透系數(shù)（Papp）的變化；SPSS軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。[結(jié)果]PNS單用時Rg1、Rb1和R1的Papp值分別為（0.49±0.09）cm/秒、（0.07 ±0.03）cm/秒、（0.58±0.04）cm/秒；PNS 與冰片配伍后 Rg1、Rb1和 R1的 Papp分別為（1.17±0.08）cm/秒、（0.16±0.02）cm/秒、（1.57± 0.50）cm/秒，分別是單用PNS的2.4、2.2和 2.7倍；而與外排轉(zhuǎn)運蛋白 P-糖蛋白（P-gp）抑制劑環(huán)孢素 A（CsA）合用時，這 3種成分的 Papp值分別為（0.62 ± 0.09）cm/秒、（0.12 ± 0.04）cm/秒、（0.90 ±0.26）cm/秒，與PNS單用組均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。[結(jié)論]PNS中Rg1、Rb1和R13種成分均為低滲透性成分；冰片可顯著提高PNS的Qt和Papp，促進其口服吸收；CsA對PNS的Qt和Papp沒有顯著影響，推測Rg1、Rb1和R1不是P-gp的底物，冰片提高其Qt和Papp可能主要受細(xì)胞旁路機制影響。

人參皂苷 Rg1；人參皂苷 Rb1；三七皂苷 R1；藥物溶出/吸收仿生系統(tǒng)（DDASS）；表觀滲透系數(shù)（Papp）

藥物溶出/吸收仿生系統(tǒng)（DDASS）是近幾年發(fā)展起來的連續(xù)動態(tài)評價藥物溶出和跨膜透過特征的新型評價技術(shù)[1-4]。2003年He等[3]將該體系用于解析經(jīng)口投藥后藥物的崩解、溶出和膜透過規(guī)律；2004年He等[4]建立了不同的胃酸模型，研究不同胃酸情況下對制劑的藥物溶出率和跨膜吸收率的影響。在此基礎(chǔ)上本課題組對該體系進行了改進，成功用于評價丹酚酸B緩釋片的釋藥規(guī)律[5]以及單硝酸異山梨酯4種不同制劑的釋藥規(guī)律及體內(nèi)外相關(guān)性研究[6]。本文采用新型藥物溶出/吸收仿生系統(tǒng)探討復(fù)方丹參方中三七總皂苷（PNS，以Rg1、Rb1和R1為檢測成分）與冰片配伍前后的跨膜透過性、吸收機制等，為創(chuàng)新中藥研究提供一種新技術(shù)和新方法，提高新藥研發(fā)的成藥性。此前有采用大鼠在體單向灌流模型[7]、大鼠不翻轉(zhuǎn)腸囊模型[8]、Caco-2細(xì)胞模型[9]、體內(nèi)動物吸收模型[10]等不同方法對傳統(tǒng)藥方復(fù)方丹參方中PNS或PNS與冰片的配伍對進行膜透過性、吸收機制等研究的報告，為驗證DDASS方法提供了可行性。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 三七總皂苷（人參皂苷Rg1>20%、人參皂苷Rb1>30%、三七皂苷R1>5%，南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司）；人參皂苷Rg1對照品（批號：110745200702，純度98%）、人參皂苷Rb1對照品（批號：110704200921，純度 92.6%）、三七皂苷 R1對照品（批號：110704200921，純度 98%）、冰片（批號：1107432200904）、環(huán)孢素 A（CsA）對照品（批號：30495200202），均購自中國藥品生物制品檢定所；水為純水，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 實驗動物 Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量（250±20）g，購買于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，動物合格證號：SYXK（津）2009-0001。在（25±2）℃，相對濕度45%～65%，光照/黑暗為12 h/12 h條件下飼養(yǎng)，自由飲食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實驗。

1.3 儀器

1.3.1 主要儀器 Merrler Toledo AX205十萬分之一天分析天平（瑞士MettlerToledo公司）；Waters600E自動型高效液相儀（美國Waters公司）；PHSJ-4A型實驗室pH計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；Tomos Model2-16A高速離心機（美國Tomos公司）。

1.3.2 藥物溶出/吸收仿生系統(tǒng) 藥物溶出/吸收仿生系統(tǒng)（閉合式）如圖1所示，其核心部位由藥物溶解室和擴散池兩部分組成，藥物溶解室置一磁力攪拌子和載藥籃，出口部分安裝有不銹鋼篩網(wǎng)；擴散池部分，在供給室和接受室之間嵌合大鼠離體腸管，使得腸腔漿膜側(cè)為供給室，腸腔黏膜側(cè)為接受室，供給室和接受室中的介質(zhì)分別是藥物溶解液（pH=6.0）和接受液（pH=7.4）。

1.4 PNS 中 Rg1、Rb1、R13 種成分 HPLC 同時測定方法

1.4.1 HPLC色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18（4.6mm×150mm，5 μm），以（A）乙腈和（B）水為流動相進行梯度洗脫，流動相梯度0～10min為22%（A）；10～18min 為 55%（A）；18～30min 為 22%（A）。流速：1.0mL/min，檢測波長：203 nm，柱溫：30℃，進樣量：20μL。

1.4.2 儲備液的制備 精密稱定80℃干燥至恒質(zhì)量的 Rg18.06mg、Rb16.80mg、R16.72mg 對照品，置10mL容量瓶中，分別用甲醇制備成濃度為806、680、672μg/mL的儲備液，待用。

1.4.3 專屬性 以藥物溶解液作為空白對照樣品，用儲備液配置混合濃度的Rg1、Rb1和R1做為對照樣品，從擴散池的接收室中隨機取樣做為待測樣品。樣品分別經(jīng)0.45μm的微孔濾膜過濾，按“1.4.1”項下條件測定。

1.4.4 線性范圍 將上述儲備液用流動相混合稀釋制備成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.4.1”項下條件測定峰面積，以Rg1、Rb1、R1的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積值為縱坐標(biāo)進行線性回歸。

1.4.5 準(zhǔn)確度和精密度 精密稱量Rg1、Rb1、R1對照品配制高中低3個濃度各3份，按“1.4.1”項下條件測定，準(zhǔn)確度結(jié)果以R E（%）表示。上述溶液每日測定3次，連續(xù)測定3 d，計算日內(nèi)精密度和日間精密度 RSD（%）。

1.4.6 穩(wěn)定性考察 取實驗PNS供試品溶液，按“1.4.1”項下色譜條件，分別于 0、1、2、4、6、8 h 測定室溫下樣品的峰面積，計算8h內(nèi)峰面積的RSD（%）。

1.5 實驗方法

1.5.1 藥物溶出/吸收仿生系統(tǒng)法（閉合式） 腸管安裝：Wistar大鼠實驗前禁食不禁水12 h，頸動脈脫臼處死，立即沿著腹中線打開腹腔，剪下空腸（自幽門15 cm處開始）段約2 cm，放入平面皿中（內(nèi)有預(yù)先氧氣飽和的接受液），小心去除腸系膜和表面脂肪，用37℃氧氣飽和接受液洗凈。用眼科剪沿腸系膜將該段腸管剖開，立刻小心安裝在擴散池中間，安裝的腸管兩側(cè)通混合氧氣（95%O2+5%CO2），整個實驗過程中保持各緩沖液溫度為37℃。

樣品采集：使用圖1裝置進行實驗，將藥物粉末加至藥物溶解室中開始實驗，溶解的藥物隨藥物溶解液流入藥物擴散池，繼而由恒速蠕動泵泵回藥物溶解室，藥物溶解液的流速由恒速蠕動泵控制在0.5mL/min；分別在 20、30、40、60、90、120、150、180、210、240min從接受室取150μL樣品，同時補充150μL空白接收液，待測樣品處理后按照“1.4.1”項下色譜條件測定。

1.5.2 實驗分組 PNS單用組：PNS原料藥投藥量為 36mg；（PNS＋冰片）組：PNS 原料藥 36mg，冰片用量 1.5mg/mL；（PNS＋CsA）組：PNS 原料藥 36mg，CsA用量0.5μg/mL。

1.5.3 數(shù)據(jù)處理

其中：Qt為藥物各時間的累積透過量；Ct為t時刻透過的藥物濃度；V為接收室中加入接收液的體積，實驗中為5.5mL[11]。

公式（2）中Qt為累積透過量；D為投藥量。

在符合漏槽條件，即供給側(cè)藥物濃度是接受測藥物濃度的10倍以上，化合物的表觀滲透系數(shù)Papp可根據(jù)如下方程計算：

公式（3）中，dQ/dt為單位時間內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運量；C0為供給池中藥物的濃度；A是轉(zhuǎn)運或擴散的表面積，本次實驗中大鼠離體小腸的表面積為（2.0×1.0）cm2；Papp單位以 cm/秒表示。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差進行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果與結(jié)論

2.1 PNS（Rg1、Rb1、R1）HPLC 測定方法的驗證

2.1.1 專屬性 如圖2所示，藥物溶解液對PNS中3種成分色譜峰無干擾，3種成分能很好分離，互不干擾，專屬性良好。

2.1.2 線性范圍 PNS中Rg1、Rb1、R1系列濃度（X）-峰面積（Y贊）線性回歸方程見表1，表明這3種成分均呈現(xiàn)良好相關(guān)性。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果Tab.1 Resultsof standard curve

2.1.3 準(zhǔn)確度和精密度 PNS中 Rg1、Rb1、R1的準(zhǔn)確度RE%和日內(nèi)、日間精密度RSD%結(jié)果見表2，表明該方法準(zhǔn)確度、精密度均符合要求。

表2 準(zhǔn)確度和精密度測定結(jié)果（n＝3）Tab.2 Accuracy and precision for thedeterm ination of Rg1,Rb1,R1（n＝3）

2.1.4 穩(wěn)定性考察 PNS樣品溶液中 Rg1、Rb1、R1在不同時間點峰面積的RSD為1.34%、1.26%、1.41%，表明PNS樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定性符合要求。

2.2 DDASS法 按“1.5.1”項下實驗法，取樣分別測得各個時間點Rg1、Rb1和R1透過濃度，按“1.5.3”項下計算其累計透過量，結(jié)果如圖3所示。

單用PNS時Rg1、Rb1和R1在DDASS體系中腸跨膜累積透過率分別是 （0.037±0.021）%、（0.032±0.010）%和 （0.011±0.003）%，均小于文獻中報道DDASS體系跨膜透過百分率的界限值0.04%[3]；計算Rg1、Rb1和R1透過大鼠離體腸管的Papp結(jié)果如表3所示，3種成分大鼠腸管的表觀滲透系數(shù)都小于界限值1×10-6cm/s[12-13]，綜上表明該3種成分滲透性差，預(yù)測三七總皂苷在體內(nèi)吸收差，生物利用度低。曾昭征等[14]在復(fù)方配伍對三七總皂苷生物藥劑學(xué)性質(zhì)的影響研究中也證實了這一點。

從圖3（A）可以看出PNS與冰片配伍后提高了Rg1和R1的累積透過量；表3顯示與冰片配伍后Rg1、Rb1和 R1的 Papp分別增大 2.4、2.2 和 2.7 倍，配伍組與 PNS 組比較，Rg1、Rb1、R1的 Papp值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），表明冰片對PNS中3種主要成分的吸收均有促進作用，可以提高其生物利用度。從圖3（B）可以看出PNS與CsA合用后，對3種成分的累計透過量沒有顯著影響，表3顯示PNS和CsA合用后與PNS組比較，Rg1、Rb1和R1的Papp差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），表明CsA對這3種成分的吸收沒有顯著性影響，推測Rg1、Rb1和R1可能不是P-gp的底物。

表3 PNS與冰片配伍及CsA干預(yù)前后Rg1、Rb1、R1的Papp（n=3，±s）Tab.3 The Papp of Rg1,Rb1 and R1 after PNS compatibility with borneolor simultaneously used with CsA（n=3，±s）

表3 PNS與冰片配伍及CsA干預(yù)前后Rg1、Rb1、R1的Papp（n=3，±s）Tab.3 The Papp of Rg1,Rb1 and R1 after PNS compatibility with borneolor simultaneously used with CsA（n=3，±s）

注：配伍組與 PNS 組相比，*P<0.05，**P<0.01。

Papp×10-6（cm/秒）人參皂苷Rg1 人參皂苷Rb1 三七皂苷R1 PNS 組 0.49±0.09 0.07±0.03 0.58±0.04 PNS＋冰片組 1.17±0.08** 0.16±0.02* 1.57±0.50*PNS＋CsA 組 0.62±0.09 0.12±0.04 0.90±0.26組別

3 討論

冰片促進吸收的機制可能有2種：一是冰片有類似CsA的作用，抑制細(xì)胞膜上P-gp的活性；二是冰片可以開放細(xì)胞間緊密連接[15-16]。CsA是P-gp的強抑制劑，通過抑制P-gp轉(zhuǎn)運體的活性，從而促進P-gp底物的吸收。結(jié)合2.2分析，推測Rg1、Rb1和R1可能不受P-gp外排蛋白轉(zhuǎn)運機制影響，PNS中Rg1、Rb1和R1可能主要通過細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運機制被吸收。目前為止，研究者用不同的方法對PNS的藥理作用、吸收特點、配伍規(guī)律等進行了研究，其中鄧震亭等[8]用大鼠不翻轉(zhuǎn)腸囊模型對R1吸收的研究，發(fā)現(xiàn)R1在大鼠腸道內(nèi)的吸收有被動擴散性，R1可能不是P-gp的底物；馮亮等[10]研究表明R1和Rg1在大鼠胃腸道的吸收動力學(xué)，并考察常用的吸收促進劑對其吸收速率的影響，發(fā)現(xiàn)卡波姆和冰片對它們在小腸的吸收有顯著促進作用；韓旻等[9]采用Caco-2細(xì)胞和動物等模型研究三七皂苷的口服吸收機制，發(fā)現(xiàn)三七總皂苷（包括Rb1和Rg1）的腸道吸收機制為單純被動擴散，吸收過程不受細(xì)胞膜內(nèi)P-gp和MRP外排載體的調(diào)控，PNS中其他成分對Rb1或Rg1的吸收特性無明顯影響；以上結(jié)論與本實驗結(jié)果吻合，因此DDASS系統(tǒng)可以評價PNS的膜透過性及體內(nèi)吸收機制。

Amidon等[1]認(rèn)為藥物吸收程度受藥物跨膜透過性和溶解性兩個因素影響。體內(nèi)模型存在耗時、耗力、耗資的缺點，不適合用于藥物的高通量篩選。藥典溶出實驗?zāi)Ｐ涂梢杂糜谒幬矬w外溶出度的考察，但是不能同時評價藥物的滲透性。He等[3-4]應(yīng)用DDASS模型評價了速釋制劑在體外透過-體內(nèi)吸收之間的相關(guān)性，該模型不但可以同步評價固體制劑體外溶出-跨膜透過特征，而且考慮到輔料對藥物吸收的影響。本研究應(yīng)用DDASS模型探討了PNS與冰片配伍的膜透過規(guī)律及吸收機制，與文獻報告的結(jié)果一致，因此DDASS系統(tǒng)可以用于中藥配伍規(guī)律及機制研究，為傳統(tǒng)中藥體內(nèi)過程研究提供新技術(shù)和新方法。

[1]Amidon GL,Lennernas H,Shah VP,et al.A theoretical basis for a biopharmaceutic drug classification:the correlation of in vitro drug productdissolution and in vivo bioavailability[J].Pharm Res,1995,12(3):413-420.

[2]Galia E,Nicolaides E,Horter D,etal.Evaluation of various dissolution media for predicting in vivo performance of class I and II drugs[J].Pharm Res,1998,15(5):698-705.

[3]He X,Sugawara M,KobayashiM,et al.An in vitro system for prediction oforalabsorption of relativelywater-soluble drugsand ester prodrugs[J].Int JPharm,2003,263(1-2):35-44.

[4]He X,Kadomura S,Takekuma Y,etal.A new system for the prediction ofdrugabsorption usinga pH-controlled Caco-2model:evaluation of pH-dependent soluble drug absorption and pH-related changes in absorption[J].JPharm Sci,2004,93(1):71-77.

[5]李自強，劉志東，顧 慧，等.藥物溶出/吸收仿生系統(tǒng)研究丹酚B 緩釋制劑的釋放規(guī)律 [J].藥物評價學(xué)研究，2010，33（5）：367－373.

[6]Li ZQ,He X,Gao XM,etal.Study on dissolution and absorption of four dosage formsof isosorbidemononitrate:Level A in vitro-in vivo correlation[J].Eur JPharm Biopharm,2011,79(2):364-371.

[7]馮 亮，蔣學(xué)華，周 靜，等.三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的大鼠在體腸吸收動力學(xué)研究[J].中國藥學(xué)雜志，2006，14（41）：1097－1102.

[8]鄧震亭，孟 林.大鼠不翻轉(zhuǎn)小腸囊模型對三七皂苷R1吸收的研究 [J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，11（17）：142－144.

[9]韓 旻，韓麗妹，王青松，等.三七皂苷的口服吸收機制[J].藥學(xué)學(xué)報，2006，41（6）：498-505.

[10]馮 亮，蔣學(xué)華.三七總皂苷在大鼠體內(nèi)的藥物動力學(xué)研究[J].華西藥學(xué)雜志，2010，25（1）：46-49.

[11]KobayashiM,Masaoka Y,YamazakiY,etal.In vitro system toevaluate oral absorption of poorly water-soluble drugs:simultaneous analysison dissolution and permeation ofdrugs[J].Pharm Res,2003,20(10):1674-1680.

[12]Artursson P,Karlsson J.Correlation between oral drug absorption in humans and apparent drug permeability coefficients in human intestinal epithelial cells[J].Biochem Bioph Res Co,1991,175(3):880-885.

[13]L觟benberg R,Amidon GL.Modern bioavailability,bioequivalence and biopharmaceutics classification system,new scientific approaches to international regulatory standards[J].Eur JPharm Biopharm,2000,50(1)：3-12.

[14]曾昭征，劉建平，李素春.復(fù)方配伍對三七總皂苷生物藥劑學(xué)性質(zhì)的影響[J].藥學(xué)進展，2009，33（10）：466－472.

[15]陳艷明，王寧生.冰片對血腦屏障體外模型細(xì)胞間緊密連接和細(xì)胞吞飲囊泡的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2004，24（7）：632－634.

[16]袁 卓，張軍平，劉養(yǎng)鳳，等.P-糖蛋白與冰片促血腦屏障生理性開放的關(guān)系探討[J].天津中醫(yī)藥，2006，23（3）：261-262.

Studieson the com patibility principlesof panax notoginseng saponinswith borneolusing a novelsimulating system

GUHui1,MA Ye-tao1,XUNMing-jin1,SHIXiao-yan1,HEXin1,2
（1.Faculty ofChineseMateriaMedica,Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China；2.Tianjin State Key Laboratory ofModern ChineseMedicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]The threemain componentsofpanax notoginseng saponins(ginsenoside Rg1,Rb1and notoginsenoside R1)asquality control components,using a drug dissolution/absorption simulating system to study the change of themembrane permeability of panax notoginseng saponinsafter compatibilitywith borneoland study itspossiblemechanism.The system willbe used to study traditionalChinesemedicine,to provide a newmethod for the developmentof traditionalChinesemedicine.[Methods]HPLCmethod wasestablished todetermine the threemain constituentsofPNS(ginsenosideRg1、Rb1and notoginsenosideR1)simultaneously.DDASSwasused tostudy the changesofcumulativepermeation amountand theapparentpermeability coefficients(Papp)ofPNSaftercompatibilitywith borneol.Variance analysiswas used to analyze the differencesbetween themean values of Pappby SPSS.[Results]Pappvalues ofginsenoside Rg1,Rb1and notoginsenoside R1respectivelywere(0.49±0.09)cm/s,(0.07±0.03)cm/s,(0.58±0.04)cm/s,and itwas significantly increased after compatibilitywith borneol2.4、2.2 and 2.7 times,respectively(P<0.05).The PappvaluesofRg1,Rb1 and R1 after compatibilitywith CsA were(0.66±0.07)cm/s,(0.14±0.05)cm/s,(0.92±0.27)cm/s.Therewere no significantdifference(P>0.05)compared with PNSgroup.[Conclusion]Borneolcan increase themembrane permeability of the PNS(ginsenoside Rg1,Rb1and notoginsenoside R1),and itcan promote PNSoralabsorption and enhance itsbioavailability.CsA doesnot improve the PNSmembrane permeability.Rg1,Rb1and R1maybe notthesubstrateofP-glycoprotein.Themechanism ofenhancingpermeationbyborneolmaybe influenceby theparacellular route transport.

ginsenoside Rg1;ginsenoside Rb1;notoginsenoside R1;Drug dissolution/absorption simulating system(DDASS);permeability coefficients(Papp)

R285.5

A

1672-1519（2012）03-0284-05

教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃”（PCSIRT，IRT0973）；天津市自然科學(xué)基金重點項目（12JCZDJC26100）；國家中醫(yī)藥管理局公益性行業(yè)專項（200807051）。

顧 慧（1983-），女，碩士研究生，主要研究方向為藥物代謝動力學(xué)。

何 新。

2012-04-05）