靜態(tài)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定對(duì)乙酰氨基酚及其發(fā)光機(jī)理研究

張慧麗, 于 斐, 吳擁軍, 玉崧成, 張洪權(quán)

(1.鄭州大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院 河南 鄭州 450001； 2.鄭州大學(xué) 化學(xué)系 河南 鄭州 450001)

0 引言

對(duì)乙酰氨基酚，商品名撲熱息痛，為芳環(huán)對(duì)位取代的苯胺類藥物，有解熱鎮(zhèn)痛作用.建立快速、靈敏、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的對(duì)乙酰氨基酚含量分析方法在臨床醫(yī)學(xué)、藥理學(xué)研究以及藥物質(zhì)量控制方面有重要意義.目前，測(cè)定對(duì)乙酰氨基酚多用紫外分光光度法[1]、高效液相色譜法[2]、熒光法[3]以及化學(xué)發(fā)光法[4-5]等.Luminol-H2O2-HRP作為化學(xué)發(fā)光最經(jīng)典的體系，具有發(fā)光迅速、靈敏度高等特點(diǎn), 已經(jīng)用于一些藥物的測(cè)定[6].但該體系發(fā)光強(qiáng)度較小，發(fā)光延遲時(shí)間較短，其應(yīng)用受到一定的限制.但加入一些酚類物質(zhì)時(shí)，體系的發(fā)光信號(hào)不同程度地增強(qiáng)，背景值不同程度地被抑制，且發(fā)光時(shí)間有所延長(zhǎng).

有關(guān)對(duì)乙酰氨基酚的化學(xué)發(fā)光分析多為基于魯米諾-鐵氰化鉀發(fā)光體系，采用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)乙酰氨基酚的測(cè)定[7-9].利用靜態(tài)注射化學(xué)發(fā)光技術(shù)測(cè)定對(duì)乙酰氨基酚的研究尚未見(jiàn)報(bào)道.基于對(duì)乙酰氨基酚對(duì)luminol-H2O2-HRP體系的增強(qiáng)作用與其濃度呈線性關(guān)系，作者建立了靜態(tài)注射化學(xué)發(fā)光法，快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)了對(duì)乙酰氨基酚的含量，并對(duì)可能的發(fā)光機(jī)理進(jìn)行了探討.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

SIRIUS單管式化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀(German Berthold)；UV1601紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Japan Shimadzu)；F-4500熒光光度計(jì)(Japan Hitachi).魯米諾(J&K Chemical LTD.)、過(guò)氧化氫(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)、辣根過(guò)氧化物酶(ROCH Inc.)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；對(duì)乙酰氨基酚(河南天方藥業(yè)股份有限公司)、對(duì)乙酰氨基酚片(吉林省紅石藥業(yè)有限公司)；其他試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為MillQ純水.

1.2 樣品的處理

準(zhǔn)確稱量20片對(duì)乙酰氨基酚片劑 (標(biāo)示量:0.30 g/片)，研細(xì)、熱水溶解、過(guò)濾，取濾液稀釋定容(每毫升相當(dāng)于30 mg對(duì)乙酰氨基酚)，搖勻備用.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

SIRIUS單管式化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀參數(shù)設(shè)置為：一泵和二泵每次分別吸取100 μL的H2O2和luminol+對(duì)乙酰氨基酚，一泵延遲時(shí)間為0.1 s，二泵延遲時(shí)間為0.2 s，檢測(cè)延遲時(shí)間為0.1 s.準(zhǔn)確移取一定體積的HRP溶液于加樣管中，在選定的實(shí)驗(yàn)條件下， 記錄發(fā)光強(qiáng)度.以發(fā)光增強(qiáng)值的對(duì)數(shù)與樣品濃度的關(guān)系進(jìn)行定量分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)乙酰氨基酚的增強(qiáng)效果

以相同濃度的反應(yīng)介質(zhì)(luminol-H2O2-HRP)及相同pH值的緩沖體系(pH=8.5 Tris-HCl)，比較加入對(duì)乙酰氨基酚前后體系的相對(duì)光單位，結(jié)果如圖1.

對(duì)乙酰氨基酚：4.0×10-4 mol·L-1； 過(guò)氧化氫：1.2×10-2 mol·L-1；魯米諾： 7.0×10-4 mol·L-1； 辣根過(guò)氧化物酶：5.0×10-6 mg·mL-1；緩沖體系pH值：8.5圖1 對(duì)乙酰氨基酚對(duì)luminol-H2O2-HRP 體系發(fā)光增強(qiáng)效果圖Fig.1 Enhancement effect of acetaminophen on chemilu-minescence intensity of luminol-H2O2-HRP system

由圖1可以看出，對(duì)乙酰氨基酚能明顯增強(qiáng)luminol-H2O2-HRP體系的發(fā)光強(qiáng)度，與空白相比增強(qiáng)30倍，并且發(fā)光延遲時(shí)間較長(zhǎng)，發(fā)光值較穩(wěn)定.

2.2 發(fā)光體系的優(yōu)化

2.2.1對(duì)乙酰氨基酚濃度的選擇 考察了1.0×10-4～1.0×10-3mol/L范圍內(nèi)不同濃度對(duì)乙酰氨基酚對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響.結(jié)果顯示(見(jiàn)圖2)，在1.0×10-4～1.0×10-3mol/L范圍內(nèi)，隨對(duì)乙酰氨基酚濃度的增大發(fā)光強(qiáng)度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì).當(dāng)濃度增加到4.0×10-4mol/L時(shí)，發(fā)光值達(dá)到最大.所以，初步選擇濃度為4.0×10-4mol/L的對(duì)乙酰氨基酚來(lái)優(yōu)化其他發(fā)光底物的濃度.

2.2.2luminol濃度的選擇 考察了1.5×10-4～2.0×10-3mol/L范圍內(nèi)不同濃度的魯米諾對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖3所示.從圖3可以看出，隨著魯米諾濃度的增加，體系發(fā)光強(qiáng)度逐漸增加.當(dāng)魯米諾的濃度大于1.3×10-3mol/L時(shí)增加速度趨于緩慢.同時(shí)分別改變H2O2、HRP的濃度，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度隨魯米諾濃度變化的趨勢(shì)同圖3(圖略).故選擇此濃度用于后續(xù)試驗(yàn).

過(guò)氧化氫：1.2×10-2mol·L-1；魯米諾：7.0×10-4mol·L-1；辣根過(guò)氧化物酶：5.0×10-6mg·mL-1；緩沖體系pH值：8.5

圖2對(duì)乙酰氨基酚濃度的影響
Fig.2Effect of acetaminophen concentration on chemiluminescence intensity

對(duì)乙酰氨基酚：4.0×10-4mol·L-1；過(guò)氧化氫：1.2×10-2mol·L-1；辣根過(guò)氧化物酶：5.0×10-6mg·mL-1； 緩沖體系pH值：8.5

圖3luminol濃度的影響
Fig.3Effect of luminol concentration on chemiluminescence intensity

2.2.3過(guò)氧化氫濃度的選擇 考察了1.5×10-3～3.0×10-2mol/L范圍內(nèi)不同濃度的過(guò)氧化氫對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響.結(jié)果顯示(見(jiàn)圖4)，在1.5×10-3～6.0×10-3mol/L范圍內(nèi)，發(fā)光值隨過(guò)氧化氫濃度的增大而增大，而后逐漸下降.所以，過(guò)氧化氫濃度選擇為6.0×10-3mol/L.

2.2.4體系的pH值選擇 考察了不同pH值的Tris-HCl緩沖溶液對(duì)發(fā)光值的影響.結(jié)果顯示(見(jiàn)圖5)，當(dāng)pH為8.5時(shí)，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度最大.

對(duì)乙酰氨基酚：4.0×10-4mol·L-1;魯米諾：1.3×10-3mol·L-1；辣根過(guò)氧化物酶：5.0×10-6mg·mL-1；緩沖體系pH值：8.5

圖4過(guò)氧化氫濃度的影響
Fig.4Effect of hydrogen dioxide concentration on chemiluminescence intensity

對(duì)乙酰氨基酚：4.0×10-4 mol·L-1；過(guò)氧化氫：6.0×10-3 mol·L-1；魯米諾：1.3×10-3 mol·L-1；辣根過(guò)氧化物酶：5.0×10-6 mg·mL-1

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在所選擇的最佳條件下，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)值的對(duì)數(shù)與對(duì)乙酰氨基酚濃度在4.0×10-4～7.5×10-3mol/L 范圍內(nèi)呈線性關(guān)系.為了提高測(cè)定的精密度，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線分段繪制.濃度在4.0×10-4～6.0×10-4mol/L范圍內(nèi)回歸方程為：lg(B-B0)=-0.020 4c+7.256 9 (R2=0.996 1，n=3) ；濃度在1.0×10-3～7.5×10-3mol/L范圍內(nèi)回歸方程為：lg(B-B0)=-0.158 2c+7.176 8 (R2=0.992 2,n=3)(B為加入對(duì)乙酰氨基酚的相對(duì)發(fā)光值；B0為空白相對(duì)發(fā)光值).

2.4 精密度及檢測(cè)限

對(duì)3.2×10-3mol/L的對(duì)乙酰氨基酚溶液平行測(cè)定10次，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.68%.根據(jù)IUPAC規(guī)定，計(jì)算出對(duì)乙酰氨基酚的檢測(cè)限為1.6×10-4mol/L.

2.5 回收率

在空白樣品基質(zhì)中分別加入4.0×10-4mol/L、2.0×10-3mol/L、5.0×10-3mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，相同實(shí)驗(yàn)條件下每個(gè)濃度平行測(cè)定3次求平均回收率，結(jié)果如表1所示.

表1 回收率的測(cè)定(n=3)Tab.1 Results of recoveries

2.6 樣品的測(cè)定

按照實(shí)驗(yàn)部分所描述的方法，對(duì)對(duì)乙酰氨基酚片劑中的對(duì)乙酰氨基酚含量平行測(cè)定3次，根據(jù)發(fā)光增強(qiáng)值及標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品含量.結(jié)果如表2，用本法測(cè)得的結(jié)果與用藥典方法中紫外可見(jiàn)分光光度法[10]所得的結(jié)果相差不大.表明作者所建立的方法測(cè)定對(duì)乙酰氨基酚的含量準(zhǔn)確可靠，簡(jiǎn)單可行.

表2 化學(xué)發(fā)光法和紫外分光光度法測(cè)定結(jié)果 (n=3)Tab.2 Results of acetaminophen tablets by chemiluminescence and UV spectroscopy

3 機(jī)理探討

在魯米諾化學(xué)發(fā)光體系中，文獻(xiàn)[11]報(bào)道，發(fā)光體為激發(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸根離子(3-AP).實(shí)驗(yàn)中，使用改裝后的F-4500熒光分光光度計(jì)，選用化學(xué)發(fā)光功能項(xiàng)，掃描了luminol+H2O2+HRP和luminol+H2O2+HRP+對(duì)乙酰氨基酚發(fā)光體系，發(fā)現(xiàn)兩者的最大峰均為425 nm，這與文獻(xiàn)報(bào)道的3-AP的最大峰一致，說(shuō)明本體系的發(fā)光體仍為激發(fā)態(tài)的3-AP.對(duì)乙酰氨基酚的加入只是改變了體系中激發(fā)態(tài)的3-AP的產(chǎn)生速率.

為了明確對(duì)乙酰氨基酚在本體系中所起的作用，用紫外分光光度計(jì)掃描了不同溶液混合后的吸收光譜，如圖6所示.由曲線a可以觀察到，在pH=8.5的緩沖溶液中魯米諾的紫外-可見(jiàn)吸收光譜有三個(gè)吸收峰，第一吸收峰可認(rèn)為是分子內(nèi)π-π*躍遷， 它需要的能量較低，吸收峰一般處于紫外光區(qū)，其特征摩爾吸光系數(shù)較大，一般大于104，為強(qiáng)吸收帶.當(dāng)luminol與H2O2、HRP作用生成3-氨基鄰苯二甲酸根離子時(shí)，π鍵活動(dòng)性增加，使基態(tài)π與激發(fā)態(tài)π*間的能量差減小，所以共軛π電子躍遷吸收帶向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，同時(shí)摩爾吸光系數(shù)增大；而第二、第三吸收峰為分子內(nèi)相應(yīng)基團(tuán)n-π*的躍遷，因?yàn)檫@些基團(tuán)不涉及π鍵的積累與否，所以無(wú)紅移、藍(lán)移現(xiàn)象產(chǎn)生，只有隨著濃度的降低，吸收峰下降的變化趨勢(shì)，比較圖6中的曲線a、b、c，正好與此一致.

加入對(duì)乙酰氨基酚后，測(cè)得其混合溶液的紫外-可見(jiàn)吸收光譜，見(jiàn)曲線d，與之相比較作出e和f的理論疊加曲線g，g、d兩曲線相比較可以明顯看到，加入對(duì)乙酰氨基酚后魯米諾的紫外-可見(jiàn)吸收特性表現(xiàn)出并非簡(jiǎn)單疊加，特別是第一吸收峰有明顯的提高，可能的原因是對(duì)乙酰氨基酚上存在的具有吸電子效應(yīng)的乙?；⑶胰〈鶠殡s氮原子，所對(duì)應(yīng)的苯氧自由基由于π-離域效應(yīng)而更穩(wěn)定，可作為HRP的第二底物(即供AH)，顯著加快酶的循環(huán)速度，導(dǎo)致魯米諾游離基的濃度增大，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增加[12]，同時(shí)由于π鍵的積累吸收峰發(fā)生一定的紅移現(xiàn)象.

a：1.3×10-3mol·L-1魯米諾；b：1.3×10-3mol·L-1魯米諾+6.0×10-3mol·L-1過(guò)氧化氫；c：1.3×10-3mol·L-1魯米諾+6.0×10-3mol·L-1過(guò)氧化氫+5.0×10-6mg·mL-1辣根過(guò)氧化酶

d：1.3×10-3mol·L-1魯米諾+6.0×10-3mol·L-1過(guò)氧化氫+5.0×10-6mg·mL-1辣根過(guò)氧化酶+4.0×10-4mol·L-1對(duì)乙酰氨基酚；e：1.3×10-3mol·L-1魯米諾+6.0×10-3mol·L-1過(guò)氧化氫+5.0×10-6mg·mL-1辣根過(guò)氧化酶；f：4.0×10-4mol·L-1對(duì)乙酰氨基酚;g:e和f的理論疊加曲線

圖6不同溶液混合后的吸收光譜
Fig.6Absorption spectra of different mixing solutions

4 結(jié)論

1)對(duì)乙酰氨基酚增強(qiáng)發(fā)光效果顯著，是化學(xué)發(fā)光luminol-HRP-H2O2體系中一種較為經(jīng)濟(jì)的增強(qiáng)劑，且實(shí)驗(yàn)用水作為溶劑，與其他用N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亞砜作為溶劑的酚類增強(qiáng)劑相比，對(duì)環(huán)境污染小，是一種很有前途的綠色發(fā)光增強(qiáng)劑.

2)利用對(duì)乙酰氨基酚的增強(qiáng)效果與其濃度的關(guān)系，建立了測(cè)定解熱鎮(zhèn)痛的非處方藥品中對(duì)乙酰氨基酚含量的測(cè)定方法.該方法簡(jiǎn)單、快速并且精密度、準(zhǔn)確度都較為滿意，受藥品輔料的干擾較小，是一種很有前景的測(cè)定方法.

3)在研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)乙酰氨基酚的加入改變了luminol-H2O2-HRP體系中激發(fā)態(tài)的產(chǎn)生速率從而使發(fā)光信號(hào)增強(qiáng).

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