過氧化苯甲酰對大鼠精子數(shù)量和功能的影響＊

羅文海 張慶鳳

1 濱州醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)教研室，山東省煙臺市 264003； 2 煙臺毓璜頂醫(yī)院麻醉科

許多研究顯示，近半個世紀(jì)以來男性生殖功能出現(xiàn)了明顯下降［1，2］，已經(jīng)廣泛關(guān)注其原因。過氧化苯甲酰是我國常用的面粉增白劑，它在我國食品環(huán)境中超標(biāo)準(zhǔn)使用比較普遍。然而關(guān)于過氧化苯甲酰毒性研究的報道不多［3］，雖然過氧化苯甲酰能夠改善面粉品質(zhì)，但也有破壞食品中營養(yǎng)素和產(chǎn)生自由基、損傷 DNA、致腫瘤等副作用［3，4］，如它對皮膚組織有致癌性。已知雄性生殖系統(tǒng)對化學(xué)毒物的損害十分敏感［5］，然而過氧化苯甲酰對雄性生殖細胞毒性研究的報道甚少。本文擬初步探討過氧化苯甲酰對雄性大鼠精子數(shù)量、形態(tài)和活力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實驗儀器與試劑 過氧化苯甲酰（benzoyl peroxide，BPO），由國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號120090109。OLYMPUS顯微鏡等。

1.2 實驗動物及分組 健康成年雄性Wistar大鼠40只，清潔級，由煙臺綠葉制藥有限公司實驗動物中心提供。40只大鼠隨機分為4組，每組10只，體重（115±18）g，在正常環(huán)境下飼養(yǎng)1周后進行實驗。這4組分別是：對照組、過氧化苯甲酰低劑量組（以下簡稱低劑量組）、過氧化苯甲酰中劑量組（以下簡稱中劑量組）、過氧化苯甲酰高劑量組（以下簡稱高劑量組）。

1.3 實驗方法 對照組喂食正常飼料，過氧化苯甲酰由大鼠飼料給藥。低劑量組、中劑量組和高劑量組施加過氧化苯甲酰的劑量分別是大鼠過氧化苯甲酰LD50的1/10、1/50和1/300。連續(xù)染毒16周。

1.4 測量指標(biāo) 在第16周末處死大鼠，取附睪。將附睪縱向剪4刀放入37℃水浴內(nèi)的4ml生理鹽水中，待5min使精子游出。棄去附睪組織，取精子懸液滴片，每只小鼠計數(shù)200個精子［6］，作精子活力分析，在20～25℃環(huán)境下10min計數(shù)完畢。精子活力分為快速前向運動、慢速前向運動、非前向運動和不動四級。計算精子活力構(gòu)成比和精子活動率。將精子懸液置65℃水浴內(nèi)10min，以殺死精子。用血球計數(shù)板作精子計數(shù)。取滅活精子懸液涂片，干燥、甲醇固定、2%伊紅染色1h，高倍鏡下鏡檢作精子形態(tài)分析，每只大鼠計數(shù)1 000個精子。常見精子畸形為頭部無定形、香蕉形、無鉤形、雙頭、胖頭、小頭以及尾折疊、雙尾等，作大鼠精子畸形構(gòu)成分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，用方差分析等方法進行檢驗。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠精子活力構(gòu)成數(shù)據(jù)見表1。

對表1四組大鼠精子活力構(gòu)成比較得，χ2＝1 075.58，P＜0.01。說明四組大鼠精子活力構(gòu)成差別有統(tǒng)計學(xué)意義。從表1可見，對照組能夠前向運動、具有良好精子功能的1、2級精子占49.1%，而低劑量組、中劑量組、高劑量組分別占48.6%、31.4%和11.8%，并且高劑量組有2只鼠未查到精子，因此高劑量組精子合計數(shù)為1 600而不是2 000。這說明過氧化苯甲酰的劑量越大，其危害越重。

2.2 四組大鼠精子活動率、精子計數(shù)和精子總畸形率數(shù)據(jù)比較見表2。

表2 四組大鼠精子活動率、精子計數(shù)和精子總畸形率比較（，n＝10）

表2 四組大鼠精子活動率、精子計數(shù)和精子總畸形率比較（，n＝10）

注：實驗組與對照組比較，a：P＜0.05，b：P＜0.01。

分組 精子活動率（%）精子計數(shù)（1010/L） 精子總畸形率（%）對照組 62.90±8.15 91.40±9.116.30±2.47低劑量組 61.35±9.06 86.26±8.56 9.88±3.45中劑量組 50.25±6.78b 79.80±6.74b 10.99±3.87a高劑量組 17.88±4.56b 24.02±3.71b 19.28±5.86b

由表2可見，從對照組到低、中、高劑量組，大鼠精子活動率依次降低，其中高劑量組活動率下降幅度尤為明顯。對照組活動率與中、高劑量組比較，均P＜0.01，差別有統(tǒng)計學(xué)意義。對大鼠精子計數(shù)分析，從對照組到低、中、高劑量組依次降低，以高劑量組精子計數(shù)下降幅度最大。對照組精子計數(shù)與中、高劑量組比較，均P＜0.01，差別有統(tǒng)計學(xué)意義。從對照組到低、中、高劑量組，大鼠精子總畸形率逐漸增加，其中高劑量組總畸形率急劇增加。對照組總畸形率與中、高劑量組比較，分別為P＜0.05、P＜0.01，差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 大鼠精子形態(tài)畸形分為尾折疊、無定形、無鉤形及其他畸形。四組大鼠精子畸形的構(gòu)成比較見表3。

表3 四組大鼠精子畸形的構(gòu)成比較（n＝10）

對表3四組大鼠精子形態(tài)總畸形構(gòu)成比較得，χ2＝118.06，P＜0.01。說明四組大鼠精子形態(tài)畸形構(gòu)成差別有統(tǒng)計學(xué)意義。從表3可見，四組大鼠精子形態(tài)“無鉤形”和“其他”畸形構(gòu)成比相差不大，而“尾折疊”的構(gòu)成比從對照組、低劑量組、中劑量組到高劑量組依次減小，“無定形”的構(gòu)成比從對照組、低劑量組、中劑量組到高劑量組依次增大，其中高劑量組的“無定形”構(gòu)成比比對照組高16%。

由表3可見，在大鼠精子畸形的分類構(gòu)成中，以尾折疊、無定形為主［7］。進一步對大鼠精子尾折疊、無定形畸形進行分析，計算出尾折疊、無定形的發(fā)生率，見表4。

表4 四組大鼠精子畸形尾折疊、無定形發(fā)生率比較（，n＝10）

表4 四組大鼠精子畸形尾折疊、無定形發(fā)生率比較（，n＝10）

注：＊高劑量組有兩鼠未見精子，按8只大鼠計。實驗組與對照組比較：a為P＜0.05，b為P＜0.01。

分組 尾折疊發(fā)生率（%） 無定形發(fā)生率（%）對照組 3.29±0.651.65±0.42低劑量組 4.25±0.81a 2.31±0.89中劑量組 4.16±0.93a 3.69±1.03b高劑量組＊ 6.76±1.24b 8.04±1.17b

由表4可見，對照組、低、中劑量組大鼠精子尾折疊發(fā)生率相差不大，只是高劑量組發(fā)生率增加較為明顯（P＜0.01）。從對照組到低、中、高劑量組，大鼠精子無定形發(fā)生率逐漸增加，其中高劑量組發(fā)生率是對照組的4倍多。其中對照組無定形發(fā)生率與中、高劑量組比較，均P＜0.01，差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

過氧化苯甲酰不僅能破壞食品中的營養(yǎng)素，還能損害肝臟、導(dǎo)致膽結(jié)石，并與腫瘤的發(fā)生相關(guān)，動物實驗證實過氧化苯甲酰對舌癌、口腔癌的發(fā)生有促進作用［8］。這提高了人們對其毒性的重視。另一方面，目前雖然人們的生活水平在不斷地提高，而男性成人的生殖功能卻較以前有所降低。這與人們的生活環(huán)境、食品衛(wèi)生質(zhì)量有關(guān)［1］。也許這與過量攝入過氧化苯甲酰有關(guān)。

對表1的分析結(jié)果可見，四組大鼠精子活力構(gòu)成有明顯差別。從對照組、低劑量組、中劑量組到高劑量組精子的前向運動能力依次降低，并且高劑量組有2只染毒鼠未查到精子。此外對表2大鼠精子活動率結(jié)果的分析，可以得出類似的結(jié)論。這說明過氧化苯甲酰對大鼠精子活力有影響，并且隨著暴露劑量的增大，其危害也越來越重。而精子的前向運動能力是精子完成其生殖功能的基礎(chǔ)，過氧化苯甲酰能明顯損害精子的活力，也許這與當(dāng)前人群男性生殖功能下降有些關(guān)聯(lián)。過氧化苯甲酰對大鼠精子活動功能的影響或許與過氧化苯甲酰的化學(xué)特性和對機體代謝有多方面影響有關(guān)。Kennedy等認為過氧化苯甲酰具有強親脂性，能產(chǎn)生自由基和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)［3，9］。在哺乳動物精子膜上有 K＋、Na＋、Ca2＋、Cl－等離子通道的存在，它們在精子的生理活動中起著重要的作用。此外精子的生理活動還需要cAMP、cGMP、ATP和蛋白激酶等物質(zhì)參與。在影響精子生理活動的離子中，Ca2＋最為引人注目。而Ca2＋等離子的跨膜轉(zhuǎn)運需要cAMP、cGMP和ATP等因子的協(xié)助。這些通道和因子的任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題均可以導(dǎo)致精子數(shù)量和形態(tài)的異常及精子活力的下降［10］。據(jù)此推測過氧化苯甲酰或許通過影響生物膜上離子通道等途徑引起大鼠精子活動功能的異常。

精子計數(shù)是大鼠雄性生殖功能的主要指標(biāo)，本研究表明隨著過氧化苯甲酰的劑量增大，其減少大鼠精子計數(shù)的作用開始顯現(xiàn)，嚴(yán)重時可以導(dǎo)致無精癥，在高劑量組有2只鼠未查到精子，其他各組大鼠未見無精子現(xiàn)象。對精子形態(tài)的分析結(jié)果分別見表2的總畸形率比較和表3、表4的資料。表2顯示，隨著過氧化苯甲酰的劑量增大，精子總畸形率隨之增大。表3顯示“無定形”的構(gòu)成比從對照組、低劑量組、中劑量組到高劑量組依次增大。由表4可見大鼠精子尾折疊發(fā)生率的劑量反應(yīng)關(guān)系遠不如精子無定形發(fā)生率劑量反應(yīng)關(guān)系明顯，說明過氧化苯甲酰劑量與精子頭部畸形發(fā)生有些關(guān)聯(lián)。而大鼠精子無定形畸形發(fā)生的部位是在精子頭部，這種頭部的畸形極易導(dǎo)致不孕的后果。綜上所述，隨著過氧化苯甲酰的劑量增大，其導(dǎo)致大鼠精子畸形的作用開始顯現(xiàn)，并且劑量越大，其危害越嚴(yán)重。過氧化苯甲?；蛟S通過對大鼠精子細胞的離子通道和遺傳物質(zhì)的影響而引起大鼠精子細胞的畸形。文獻報道過氧化苯甲酰能影響核苷酸轉(zhuǎn)錄、引起DNA鏈斷裂，損害 DNA［11］、tRNA［4］，促進突變和腫瘤的發(fā)生。這些都可能影響到精子的形態(tài)和功能。

［1］閏蓓.電磁輻射對男性生殖功能影響的研究現(xiàn)狀〔J〕.環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2007，24（4）：423－425.

［2］崔留欣，姜春霞，王錫林，等.氟致雄性大鼠生殖功能損害的實驗研究〔J〕.中國地方病學(xué)雜志，2003，22（3）：195－197.

［3］李偉.過氧化苯甲酞毒性的研究進展〔J〕.疾病監(jiān)測與控制雜志，2010，4（7）：391－392.

［4］Hazlewood C，Davies MJ.Benzoyl peroxide－induced damage to DNA and its components：direct evidence for the generation of base adducts，sugar radicals and strand breaks〔J〕.Archives of Biochemistry and Biophysics，1996，332（1）：79－91.

［5］童智敏，朱士新，施健，等.吸入甲醛對小鼠精子畸形率和骨髓細胞微核率的影響〔J〕.預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇，2006，12（4）：391－393.

［6］賀性鵬，蔡亞平，龍理良，等.摩托車尾氣致小鼠DNA損傷及精子畸形〔J〕.中國公共衛(wèi)生，2003，19（7）：858－859.

［7］李昱辰，陳昱，陳文芳，等.連續(xù)低功率微波照射致雄性小鼠精子畸形的研究〔J〕.環(huán)境與健康雜志，2009，26（4）：355－356.

［8］Mancuso M，Pazzaglia S，Tanori M，et al.Only a subset of 12－O－tetradecanoylphorbol－13－acetate－promoted mouse skin papillomas are promotable by benzoyl peroxide〔J〕.Mutation Research，2004，548（1－2）：35－45.

［9］Rota C，Tomasi A，Iannone A.Alpha－tocopherol amplifies benzoyl peroxide free radical decomposition in a chemical system〔J〕.Free Radical Research，2006，40（6）：637－645.

［10］馬學(xué)海，施玉.哺乳動物及人精子膜離子通道的研究進展〔J〕.生理科學(xué)進展，1998，29（2）：109－114.

［11］Kawanishi S，Oikawa S，Murata M，et al.Site－specific oxidation at GG and GGG sequences in double－stranded DNA by benzoyl peroxide as a tumor promoter〔J〕.Biochemistry，1999，38（51）：16733－16739.