口腔扁平苔蘚中抗凋亡蛋白Bcl－2的表達(dá)研究

滿 一 阿達(dá)萊提·阿合買提江 張穎奇

1 中國石油天然氣集團(tuán)公司中心醫(yī)院口腔科，河北省廊坊市 065000； 2 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科

口腔扁平苔蘚（oral lichen planus，OLP）是一種常見的病因不明的非感染性黏膜病。病理表現(xiàn)為真皮淺層存在以CD4＋和CD8＋T細(xì)胞為主的免疫細(xì)胞過度浸潤，表明局部淋巴細(xì)胞增殖和凋亡出現(xiàn)障礙，明顯的病理特點(diǎn)基底細(xì)胞液化變性；上皮棘層、顆粒層楔形增厚。本研究采用免疫組化法，通過觀察凋亡相關(guān)蛋白Bcl－2生物學(xué)行為對(duì)免疫細(xì)胞與上皮細(xì)胞凋亡的影響，初步探討扁平苔蘚發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選擇我院保存的石蠟切片共50例，其中正?？谇火つ?5例（對(duì)照組），扁平苔蘚25例（OLP組），其中網(wǎng)紋型15例，糜爛型10例。所有檢材診斷和組織學(xué)分類均依據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)，由同一名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)專家完成。

1.2 試劑 所有試劑均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。Bcl－2為即用型鼠抗人單克隆抗體，SP復(fù)合物MaxVisionTM為快捷即用型，通過聚合物技術(shù)把過氧化物酶與抗鼠和抗兔IgG分子結(jié)合在多聚物上形成多聚物分子，使得酶分子與二抗直接結(jié)合形成的多聚物分子高度敏感性染色強(qiáng)度增大，避免非特異性背景染色。DAB顯色試劑盒為鏈酶卵－辣根過氧化物酶（HPR）系統(tǒng)免疫組化染色Elivison，適用于SP法。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 采用免疫組化鏈霉素抗生素－過氧化物酶免疫組織化學(xué)染色方法（streptavidin－peroxi－dase，SP）檢測細(xì)胞凋亡與增值狀況。所有組織切片經(jīng)10%甲醛固定、常規(guī)脫蠟、透明、浸蠟、石蠟包埋。5μm連續(xù)切片，固定于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上，常規(guī)組織切片脫蠟入水；微波加熱10min暴露抗原；過氧化物酶溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS水沖洗，鼠抗人即用型Bcl－2抗體37℃孵育60min，加入SP復(fù)合物 HRP－MarVisionTM，30℃孵育60min；加入SP復(fù)合物 HPR，4℃過夜；DAB緩沖液、DAB底物、DAB色原順序加入、混勻成DAB顯色液滴定組織切片，室溫下顯色10min，顯色后蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，二甲苯透明，封片。以PBS代替一抗為陰性對(duì)照，Bcl－2以邁新公司提供的淋巴瘤陽性片為Bcl－2做對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 采用HM2A8－2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)，每例每張切片各隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)、不重疊200和400倍高清視野，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核染成棕色或棕紅色顆粒或彌漫成片狀為Bcl－2的陽性表達(dá)。計(jì)數(shù)切片中1 000個(gè)上皮基底細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)及高倍視野下（×400）的Bcl－2陽性染色細(xì)胞數(shù)。參照 Hueber［1］標(biāo)準(zhǔn)，將 Bcl－2表達(dá)定級(jí)為：未見陽性細(xì)胞著色為陰性（－）；陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為（＋）；11%～25%為（＋＋）；26%～50%為（＋＋＋）；＞50%為（＋＋＋＋）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 病變組織與對(duì)照組中陽性表達(dá)率以及各種臨床指標(biāo)中的表達(dá)率的差異采用χ2檢驗(yàn)；Bcl－2陽性表達(dá)率的差異采用Fisher精確概率法單因素相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包11.5版本處理。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)顯示：正常黏膜內(nèi)上皮層Bcl－2蛋白陽性細(xì)胞表達(dá)率16%，主要分布在上皮基底細(xì)胞及棘層，角化層Bcl－2蛋白弱表達(dá)，點(diǎn)狀、均勻分布，未見貫穿上皮全層的陽性染色，固有層罕見淋巴細(xì)胞，Bcl－2蛋白陽性率24%，見圖1、2。扁平苔蘚上皮細(xì)胞中Bcl－2陽性細(xì)胞主要分布于棘層、顆粒層，部分貫穿上皮全層，陽性細(xì)胞表達(dá)率48%，見圖3、4。真皮淺層密集的高強(qiáng)度Bcl－2陽性表達(dá)淋巴細(xì)胞，陽性檢出率72%，高強(qiáng)度陽性表達(dá)程度增加，各期扁平苔蘚與正?？谇火つけ容^，差異顯著，見表1。扁平苔蘚各組內(nèi)自身比較，固有層與上皮層Bcl－2陽性染色率無差異，病變組各期與對(duì)照組比較差異顯著，見表1、2。與固有層中的淋巴細(xì)胞染色相比，扁平苔蘚上皮細(xì)胞層Bcl－2蛋白的分布和密度要弱，見圖5、6。另外，Bcl－2陽淋巴細(xì)胞分布呈現(xiàn)規(guī)律性，主要表現(xiàn)出兩種分布形式：巢形分布，以數(shù)個(gè)密集排列的Bcl－2強(qiáng)陽性淋巴細(xì)胞為中央?yún)^(qū)域，周圍細(xì)胞明顯聚集，巢形團(tuán)重疊擠壓，沿真皮乳突層帶狀排列；其二無明顯聚集趨勢的散在分布，但染色強(qiáng)度未降低。

表1 Bcl－2蛋白在口腔正常黏膜、扁平苔蘚病損各組織中的表達(dá)

表2 Bcl－2在對(duì)照組與OLP組織中表達(dá)率的比較（）

表2 Bcl－2在對(duì)照組與OLP組織中表達(dá)率的比較（）

注：對(duì)照組內(nèi)▲為t＝2.971，P＞0.05，OLP組與對(duì)照組比較★為t＝5.475，P＜0.05。

分組 n Bcl－2陽性表達(dá)上皮層 固有層對(duì)照組 25 14.41±0.01 27.44±0.13▲OLP組 25 51.95±0.25 67.05±0.42★

圖1 Bcl－2在正?？谇火つど掀ぶ腥醣磉_(dá)

圖2 Bcl－2在正?？谇火つ?上皮中弱表達(dá)

圖3 網(wǎng)紋型OLP的Bcl－2表達(dá)，淋巴細(xì)胞浸潤帶斷裂，基底較完整

圖4 糜爛型OLP的Bcl－2 表達(dá)，基底液化，棘 層增厚

圖5 扁平苔蘚皮損中淋巴細(xì)胞巢型分布

圖6 扁平苔蘚皮Bcl－2高 表達(dá)，棘層增厚

3 討論

本研究系統(tǒng)地觀察了健康口腔黏膜與OLP各期病損區(qū)細(xì)胞凋亡狀況，顯示包括正常黏膜在內(nèi)的所有上皮細(xì)胞均有抑制凋亡蛋白Bcl－2陽性表達(dá)，是一種普遍現(xiàn)象，這與國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道符合［2，3］。正常口腔黏膜中，Bcl－2陽性細(xì)胞主要分布在上皮基底細(xì)胞及棘層，這符合細(xì)胞分化周期過程。Bcl－2正常表達(dá)可保證角質(zhì)形成細(xì)胞增殖分裂能力，并向上移行分化成熟至表面衰老死亡，完成連續(xù)的細(xì)胞周期。Bcl－2敲除（kick out）實(shí)驗(yàn)證實(shí)［4］，生理狀況下 Bcl－2正常分泌是細(xì)胞周期連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)及細(xì)胞數(shù)量相對(duì)平衡的需要，有利于順利通過G2/M細(xì)胞周期調(diào)控點(diǎn)，觸發(fā)有絲分裂，Bcl－2表達(dá)缺乏則休眠期細(xì)胞增多，正常發(fā)育細(xì)胞將暫時(shí)或永久退出細(xì)胞周期。當(dāng)細(xì)胞周期完成即將通過凋亡而發(fā)生克隆消失時(shí)，Bcl－2的表達(dá)則應(yīng)下調(diào)［5］，維持口腔黏膜上皮的分層結(jié)構(gòu)并保持細(xì)胞數(shù)目的動(dòng)態(tài)平衡。而Bcl－2蛋白過表達(dá)，不成熟細(xì)胞存活增加，細(xì)胞壽命延長，數(shù)量積累。

實(shí)驗(yàn)顯示與扁平苔蘚上皮層相比，真皮層淋巴細(xì)胞浸潤帶Bcl－2染色強(qiáng)度跳躍式增強(qiáng)，但分布并不連續(xù)均勻，存在局域性差異。巢形分布集中區(qū)域，淋巴細(xì)胞的Bcl－2特異性免疫反應(yīng)活躍，對(duì)應(yīng)的上方既可以出現(xiàn)表皮楔形增厚，又能觀察到明顯的基底細(xì)胞液化，楔形增厚之間的界面大多破壞明顯；同時(shí)也觀察到基底層趨于較為完整，棘層也并無明顯增厚，與之對(duì)應(yīng)的下方真皮層Bcl－2陽性細(xì)胞連續(xù)性發(fā)生斷裂，只有點(diǎn)狀、散在Bcl－2陽性細(xì)胞浸潤，上皮層變性與Bcl－2陽性表達(dá)的淋巴細(xì)胞強(qiáng)度似有明確的上下對(duì)應(yīng)關(guān)系。統(tǒng)計(jì)學(xué)也顯示，OLP病損區(qū)與照組固有層淋巴細(xì)胞Bcl－2陽性表達(dá)率差異有顯著性。對(duì)此筆者推測：（1）免疫細(xì)胞生物活性的增強(qiáng)與抑凋亡蛋白 Bcl－2 過 表 達(dá) 有 關(guān) 系 。 相 關(guān) 研 究 表 明［6］，Bcl－2與CD4＋、CD8＋細(xì)胞及存在于生發(fā)中心的T細(xì)胞有高度的親和力，Bcl－2在T淋巴細(xì)胞發(fā)育成熟期活性增強(qiáng)，Bcl－2過表達(dá)致自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞逃避了胸腺的陰性選擇而持續(xù)存在。（2）上皮基底層的液化變性并不是內(nèi)在因素所致，而是Bcl－2活化后的淋巴細(xì)胞攻擊和誘導(dǎo)，這種方式的損傷主要是Tc細(xì)胞、NK細(xì)胞通過釋放穿孔素致角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡，液化變性。研究表明淋巴細(xì)胞的活化又可增加bcl－2的轉(zhuǎn)錄，延遲成熟淋巴細(xì)胞死亡，淋巴細(xì)胞數(shù)量絕對(duì)值增加，特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活力增強(qiáng)；激發(fā)淋巴因子釋放；（3）OLP中淋巴細(xì)胞的聚集可能受到Bcl－2激活趨化。相關(guān)研究顯示［7］，被淋巴細(xì)胞破壞后的上皮細(xì)胞又可以產(chǎn)生RANTES（regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor，RANTES）、IL－6等炎性因子，而 Bcl－2誘導(dǎo)活化后的T淋巴細(xì)胞受體對(duì)RANTES、IL－6敏感性增強(qiáng)，游走能力增強(qiáng)，穿越血管內(nèi)皮持續(xù)性歸巢，吸引更多的淋巴細(xì)胞到皮損區(qū)。

除真皮層過度的淋巴細(xì)胞浸潤外，在組織病理上OLP屬于苔蘚樣界面皮炎，上皮增殖也是其特點(diǎn)。與正?？谇簧掀け容^，本實(shí)驗(yàn)顯示扁平苔蘚顆粒層灶性楔形增厚，棘層不規(guī)則增厚，角化不全，表皮突延長呈鋸齒狀。Bcl－2陽性表達(dá)主要位于扁平苔蘚皮損區(qū)棘層，且陽性表達(dá)率高于正常人組，非糜爛型上皮表達(dá)率達(dá)最高，而在糜爛型則有所下降。據(jù)此推測Bcl－2的過表達(dá)抑制棘層細(xì)胞凋亡，致使棘層增厚，使角朊細(xì)胞壽命延長，導(dǎo)致棘層和顆粒層增厚。MaCall和Smith等人在對(duì)正常皮膚角質(zhì)細(xì)胞的觀察中發(fā)現(xiàn)多位于角化下層，認(rèn)為正常角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡實(shí)際上就是細(xì)胞分化的過程［8］，Bcl－2的激活干擾了細(xì)胞正常分化，上皮細(xì)胞分裂周期延長，細(xì)胞個(gè)體壽命延長，“凋亡細(xì)胞”的繼續(xù)生存影響細(xì)胞數(shù)量增加。

值得注意的是，本實(shí)驗(yàn)也觀察到有28%（25例中7例）病例可見較明顯的“表達(dá)錯(cuò)位”，即Bcl－2表達(dá)與表皮層的增厚、基底層液化變性的位置關(guān)系并不固定或呈明確的上下對(duì)應(yīng)關(guān)系。表現(xiàn)為表皮層楔形增厚而Bcl－2表達(dá)強(qiáng)度降低，Bcl－2表達(dá)增強(qiáng)而并無明顯的棘層增厚；另外以真皮淺層Bcl－2陽性表達(dá)的淋巴細(xì)胞浸潤為主，在其上方即可以出現(xiàn)灶狀基底細(xì)胞液化變性，又能觀察到基底層趨于完整。對(duì)此筆者推測Bcl－2的干預(yù)可能并不是OLP上皮改變的唯一因素，可能還有其他因素參與了基底細(xì)胞液化寄表皮層局灶性增厚的發(fā)生，并在OLP的發(fā)展中起到了相當(dāng)重要的作用。

造成Bcl－2蛋白表達(dá)在水平重度異常增生階段有所下降可能的因素是：（1）機(jī)體為抑制過度生長的細(xì)胞群體，新生細(xì)胞啟動(dòng)了某種細(xì)胞自穩(wěn)定機(jī)制，試圖促進(jìn)增殖細(xì)胞的凋亡，維持細(xì)胞數(shù)目的穩(wěn)定；（2）重度異常增生階段細(xì)胞增殖能力爆發(fā)式提高，大量病變細(xì)胞的堆積，導(dǎo)致局部缺血、缺氧、免疫細(xì)胞釋放免疫因子、細(xì)胞毒性T細(xì)胞的攻擊，而加快了老化的細(xì)胞凋亡［9］；（3）實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量偏少或其他因素影響了統(tǒng)計(jì)結(jié)果的精確性。

總之，扁平苔蘚的病變發(fā)展過程中，口腔黏膜上皮組織細(xì)胞與免疫細(xì)胞的凋亡狀況發(fā)生了改變，扁平苔蘚的發(fā)病機(jī)制與Bcl－2在特定部位的過度表達(dá)有關(guān)，但不排除其他因素的參與。

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