加味四逆散對睡眠剝奪大鼠PFC和海馬CA3區(qū)NMDA受體表達的調(diào)節(jié)作用

范新六 李 峰 宋月晗 洪志強 馬佳美 劉 燕

(1世界中醫(yī)藥學會聯(lián)合會北京御方堂中醫(yī)門診部，北京市朝陽區(qū)小營路19號，100101;2北京中醫(yī)藥大學;3世界中醫(yī)藥學會聯(lián)合會)

NMDA受體依賴性長時程增強(Long-term Potentiation，LTP)是突觸可塑性的重要形式，而NMDA受體NR2亞基是其信號轉(zhuǎn)導通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié);前額葉皮質(zhì)和海馬CA3區(qū)是參與學習與記憶的兩個重要腦區(qū)。因此，本實驗探討睡眠剝奪大鼠前額葉皮質(zhì)和海馬CA3區(qū)與突觸可塑性關(guān)系密切的NMDA受體NR2亞基(含磷酸化位點)蛋白質(zhì)表達的變化及加味四逆散對其調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 二級Spargue-Dawley雄性成年大鼠50只，體重(250±20)g，購自北京維通利華實驗動物有限公司。將大鼠適應性喂養(yǎng)3d后隨機分為正常對照組(A組)、模型組(B組)、四逆散組(C組)、生慧湯組(D組)、加味四逆散組(E組)，共5組，每組6只。

1.2 藥物 實驗所用的中藥復方分別選用《傷寒論》的四逆散(甘草、枳實、柴胡、芍藥)、《辨證錄》的生慧湯(熟地黃、山茱萸、遠志、生酸棗仁、柏子仁、茯神、人參、石菖蒲、白芥子)、加味四逆散由四逆散和生慧湯合方組成。上述復方由北京東直門醫(yī)院制劑室以嚴格工藝制成免煎顆粒。

1.3 試劑與儀器 NMDAR2B、β-actin(Santa Cruz，USA)，NMDAR 2B(Tyr1472)(Abcam，USA)。蛋白定量試劑盒、ECL超敏發(fā)光液、5×上樣緩沖液(北京普利來基因技術(shù)有限公司)。PMSF(Merck，Germany)，丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、SDS(Amresco，USA)。PVDF膜(Millipore，USA)。垂直電泳儀、電轉(zhuǎn)槽(Bio-Rad，USA)。

1.4 方法

1.4.1 模型制作 采用D.Suchecki改良多平臺法進行睡眠剝奪。在剝奪箱中放置10個平臺，在平臺周邊注滿水，把6只大鼠放置平臺上，當大鼠進入異相睡眠時，由于全身肌肉張力降低，節(jié)律性地垂頭觸水或落入水中覺醒，從而使動物始終不能進入異相睡眠。將大鼠進行異相睡眠剝奪168h。自造模第1天始，C、D、E組每日分別灌服四逆散、生慧湯、四慧合劑，按人體用藥量換算成大鼠等效劑量作為大鼠用藥量，這3組的給藥量分別為 2.5g/kg、13.75g/kg、16.25g/kg，灌胃容積為1mL/kg。A、B組則灌服等體積的蒸餾水。

1.4.2 取材 在SD168h點，每組隨機取6只大鼠，2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40mg/kg)，斷頭，在超凈臺內(nèi)冰上取腦，分別剝離出右側(cè)PFC和海馬CA3區(qū)，將樣本分別放入1.5mL滅菌的離心管中，埋入干冰，迅速轉(zhuǎn)移到-70℃的低溫冰箱中。

1.4.3 Western blot流程 使用微電動勻漿器勻漿后，采用RIPA裂解液(預冷)提取細胞總蛋白。用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度后，-20℃保存待測。蛋白標本以1∶4加入5上樣緩沖液，在5%的十二烷基磺酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離。每條泳道蛋白上樣量為30μg。電泳結(jié)束后，用電轉(zhuǎn)儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)移后的PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1h，加入一抗兔抗NMDAR2B或NMDAR 2B(Tyr1472)(1∶300)，4℃過夜。用 TBS洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1∶2000)，室溫孵育1h，TBS充分洗膜。采用超敏發(fā)光液進行曝光，X線顯影。將膠片的目的蛋白質(zhì)條帶在圖像分析系統(tǒng)上測定其灰度值。

1.5 圖像處理 采用凝膠圖像處理軟件檢測出各條帶的像素灰度值，用各指標的像素密度值除以相應的β-Actin的像素灰度值，求出各指標的相對像素灰度值。1.6統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)均以(ˉx±s)表示，兩兩比較采用t檢驗，組間比較用單因素方差分析檢驗。運用SAS8.2軟件進行分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠PFC和海馬CA3區(qū)NMDAR2B表達的改變 與對照組比較，模型組大鼠PFC和海馬CA3區(qū)NMDA受體NR2B蛋白質(zhì)的表達明顯減少(P＜0.05)。與模型組比較，加味四逆散組大鼠PFC和海馬CA3區(qū)NMDA受體NR2B蛋白質(zhì)的表達均明顯增加(P＜0.05)。見表1。

表1 大鼠各腦區(qū)NMDAR2B達的改變(ˉx±s，n=6)

2.2 各組大鼠PFC和海馬CA3區(qū)NMDA受體NR2B(Tyr1472)表達的改變 與對照組比較，睡眠剝奪168h后，大鼠PFC腦區(qū)NMDA受體NR2B(Tyr1472)蛋白質(zhì)的表達明顯減少(P＜0.05)。與模型組比較，加味四逆散組大鼠PFC腦區(qū)NMDA受體NR2B(Tyr1472)蛋白質(zhì)的表達均明顯增加(P＜0.05)。各組大鼠海馬CA3區(qū)NMDA受體NR2B(Tyr1472)蛋白質(zhì)的表達無明顯差異。見表2。

表2大鼠各腦區(qū)NMDAR 2B(Tyr1472)表達的改變(ˉx±s，n=6)

3 討論

研究表明，前額葉皮質(zhì)和海馬CA3區(qū)是參與學習與記憶的重要腦區(qū)。人體和動物實驗的研究都提示前額葉腦區(qū)與工作記憶之間存在緊密的聯(lián)系［1］。功能神經(jīng)成像研究表明事件記憶的編碼過程與左側(cè)前額葉的激活是有關(guān)的，而記憶的提取則與右側(cè)前額葉的激活有關(guān)，前額葉的背外側(cè)區(qū)是參與工作記憶的最重要的腦區(qū)。海馬CA3區(qū)在陳述性記憶中扮演主要的角色。譬如在記憶編碼上，CA3-NR1敲除顯示損傷了需要快速獲得聯(lián)合信息的任務學習［2］。學習與記憶神經(jīng)生物學基礎為突觸可塑性的改變，而LTP是突觸可塑性重要的功能指標。NMDAR2B在NMDA受體依賴性LTP誘導和維持處于主導地位。NMDAR2B主導的NMDA受體的膜表達和激活受到絲氨酸和酪氨酸位點磷酸化的特異性調(diào)控。與Ser1480位點磷酸化能減少NMDA受體在膜的表達量不同，其Tyr1472位點的磷酸化能穩(wěn)固NMDA受體在胞膜的穩(wěn)定性［3］。

根據(jù)中醫(yī)五藏神理論，心藏神，肝藏魂，腎藏精。加味四逆散以補腎、養(yǎng)心、疏肝立法，能調(diào)節(jié)心肝腎功能異常，使肝腎二藏在心“任物”功能主宰下調(diào)控學習，記憶的編碼、鞏固、再現(xiàn)等過程。本研究證明，加味四逆散能上調(diào)睡眠剝奪導致動物PFC區(qū)NMDAR2B、NMDAR2B(Tyr1472)表達的降低;也能上調(diào)睡眠剝奪導致海馬CA3區(qū)NMDAR2B表達的降低。根據(jù)既往研究結(jié)果［3］，加味四逆散能改善睡眠剝奪動物學習記憶能力，與調(diào)節(jié)PFC和CA3區(qū)NMDAR2B的蛋白質(zhì)和基因表達有關(guān)。

［1］Bussey TJ，Wise SP，Murray EA.The role of ventral and orbital PFC in conditionalvisuomotor learning and strategy use in rhesus monkeys(Nacacamulatta).BehavNeurosci，2001，115(6):971-982.

［2］Nakazawa K，Quirk MC.Requirement for hippocampal C.A3 NMDA receptors in associative memory recall.science，2002，297(5579):211 –218.

［3］范新六，李峰，宋月晗，等.四慧合劑對疲勞大鼠學習記憶及海馬NMDA受體亞基NR2A、NR2B和EphB2受體mRNA表達的影響.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，31(4)512-516.