不同力竭運動后大鼠心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)PPARα mRNA和蛋白表達的變化及其在運動性心律失常發(fā)生中的作用

常蕓 楊紅霞 彭澤胄

國家體育總局體育科學(xué)研究所（北京 100061）

運動性心律失常越來越引起運動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注，相當一部分運動性心律失常影響到運動員的身體健康、系統(tǒng)訓(xùn)練以及比賽成績［1-2］。近年，國內(nèi)外研究報道運動員心律失常發(fā)生率高于正常人，且專項訓(xùn)練年限長的運動員中更常見，運動員退賽退役屢見不鮮［3］。而運動性心律失常的發(fā)生機制又極其復(fù)雜，涉及眾多因素。盡管運動醫(yī)學(xué)界對此進行了廣泛的臨床觀察與調(diào)研，迄今，運動性心律失常的發(fā)生機制仍未完全闡明。心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)作為心電活動的控制中心和沖動傳導(dǎo)的重要部位，其特殊的組織結(jié)構(gòu)和細胞類型決定其具有不同于普通心肌的心電起搏和傳導(dǎo)功能，與各種類型心律失常的發(fā)生和發(fā)展具有密切關(guān)系［4］。

心臟終生不停的搏動依賴于心臟強大的能量代謝系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能，通常正常心肌能量的70%來源于脂肪酸氧化，因此，線粒體脂肪酸β氧化對維持心肌能量代謝和泵功能有重要意義。過氧化體增殖物激活型受體α（PPARα）作為心肌脂質(zhì)和能量代謝的重要調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控著出生后心肌線粒體編碼脂肪酸β氧化酶類的基因表達，對維持心肌能量代謝和泵功能有重要作用，而運動對心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)PPARα的影響鮮有報道。為此，本研究進行了力竭運動對心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)代謝調(diào)控PPARα表達的研究，為闡明運動性心律失常的病理改變與發(fā)生機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

健康雄性成年SD大鼠100只，8周齡，體重（220±8）g。國家標準嚙齒動物飼料喂養(yǎng)，自由飲食。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫（20±2）℃，光照時間 12小時，相對濕度40%～55%。

1.2 運動負荷

將100只實驗大鼠隨機分為10組，每組10只。其中一次力竭和2周反復(fù)力竭游泳運動各4組：運動后即刻組、4小時組、12小時組和24小時組，相應(yīng)的安靜對照組2組。安靜對照組不運動，力竭運動各組大鼠尾部負重為體重的3%，2周反復(fù)運動組每周運動6天，每天1次。力竭標準參照Thomas的報道［5］。

1.3 心電圖描記

所有大鼠于最后一次游泳訓(xùn)練前稱重。力竭運動離開水面后，迅速用熱吹風機和干布將其皮毛擦干，仰臥固定，采用ADInstruments LabChart 7記錄并分析大鼠綜合導(dǎo)聯(lián)心電圖。具體計算指標與方法見先前報道［4］。

1.4 取材

分別于最后一次力竭運動后即刻、4小時、12小時及24小時等不同時相取材，迅速取出心臟，用OCT包埋，液氮驟冷，作全心連續(xù)冰凍切片，光鏡定位心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)，運用激光顯微切割儀切割，分別收集竇房結(jié)細胞或細胞團。

1.5 實時熒光定量PCR檢測

采用Trizol法提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄cDNA，存于-20℃?zhèn)溆谩Ｍㄟ^互聯(lián)網(wǎng)搜索Genbank查找目標因子結(jié)蛋白和內(nèi)參照β-actin的引物基因序列，應(yīng)用Primer 5軟件進行引物設(shè)計（表1），設(shè)計的引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。引物擴增目標基因片斷長度均小于150 bp，其PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證引物可用后，再進行實時熒光定量PCR，其中預(yù)變性 95℃ 30 s，PCR 反應(yīng) 95℃ 10 s，60℃30 s，40個循環(huán)。檢測CT值。利用SDS2.2軟件對實時定量PCR數(shù)據(jù)進行分析處理，并導(dǎo)出文件及圖像。利用管家基因?qū)δ康幕虻谋磉_進行校正，得到相對定量結(jié)果（相對數(shù)值）。

1.6 免疫熒光檢測

采用免疫熒光組織化學(xué)方法染色心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)冰凍切片，采用Leica AD MDW活細胞多維圖成像工作站和Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)對目標因子蛋白熒光強度進行定量，熒光強度用積分灰度表示（IOD），參考陰性對照標本中的熒光強度，灰度值在40～130之間為蛋白陽性表達。

表1 PCR引物序列

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行處理，結(jié)果用平均數(shù)±標準差表示，組間比較采用多因素方差分析，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)形態(tài)觀察和心電圖變化

兩種力竭運動后，均有部分大鼠出現(xiàn)心律失常，心臟肉眼觀察有不同程度的充血，且反復(fù)力竭游泳運動后，各時相組心臟重量指數(shù)均顯著高于對照組心臟重量指數(shù)（P<0.05），具體結(jié)果詳見先前報道［4］。

2.2 PPARα mRNA表達

2.2.1 一次力竭運動

如表2所示，一次力竭游泳運動后4小時、12小時心臟竇房結(jié)PPARα mRNA表達顯著低于對照組（P<0.01，P<0.05）。一次力竭游泳運動后即刻和12小時心臟房室結(jié)PPARα mRNA表達顯著高于對照組（P<0.01）。浦肯野氏纖維PPARα mRNA表達各時相組間無顯著性差異（P>0.05）。

一次力竭游泳運動后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)不同部位PPARα mRNA表達存有差異，其中，運動后即刻房室結(jié)顯著高于竇房結(jié)（P<0.05），又顯著低于浦肯野氏纖維（P<0.01）。

總體看，一次力竭運動后傳導(dǎo)系統(tǒng)竇房結(jié)、房室結(jié)、浦肯野氏纖維PPARα mRNA表達在運動后4小時下降到低谷。其中，房室結(jié)變化較明顯。

表2 一次力竭運動后大鼠PPARα mRNA相對表達量

2.2.2 反復(fù)力竭運動

如表3所示，反復(fù)力竭游泳運動后4小時、12小時和24小時心臟竇房結(jié)、浦肯野氏纖維PPARα mRNA表達均顯著低于對照組和運動后即刻 （P<0.01），其中，運動后即刻組竇房結(jié)PPARα mRNA表達又顯著高于對照組 （P<0.01），24小時房室結(jié)PPARα mRNA表達顯著低于對照組（P<0.05）。

反復(fù)力竭游泳運動后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)不同部位PPARα mRNA表達有差異。運動后即刻房室結(jié)PPARα mRNA表達顯著高于竇房結(jié) （P<0.05），但低于浦肯野氏纖維（P<0.05），運動后4小時房室結(jié)顯著高于竇房結(jié)和浦肯野氏纖維（P<0.01）；運動后12小時房室結(jié)顯著低于浦肯野氏纖維 （P<0.05），運動后24小時浦肯野氏纖維顯著高于竇房結(jié)和房室結(jié)（P<0.01）。

總體看，反復(fù)力竭運動后傳導(dǎo)系統(tǒng)竇房結(jié)、房室結(jié)、浦肯野氏纖維PPARα mRNA表達基本一致。運動后開始下降，4小時到低谷，其中竇房結(jié)、房室結(jié)變化更明顯。

2.2.3 不同力竭方式運動比較

如圖1所示，反復(fù)力竭后即刻竇房結(jié)PPARα mRNA表達顯著高于一次力竭后即刻（P<0.05），反復(fù)力竭后12小時和24小時又顯著低于一次力竭后12 小時（P<0.05）和 24 小時（P<0.01），其他時相組間比較無明顯差異（P>0.05）。兩種不同方式力竭運動后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)房室結(jié)PPARα mRNA表達有差異，反復(fù)力竭后即刻顯著高于一次力竭后即刻（P<0.01），反復(fù)力竭后12小時顯著低于一次力竭后12小時（P<0.01），其他時相組間無明顯差異（P>0.05）。反復(fù)力竭后24小時心臟浦肯野氏纖維PPARα mRNA表達顯著低于一次力竭后24小時（P<0.01），其他各時相組間無明顯差異（P>0.05）。

表3 反復(fù)力竭運動后大鼠PPARα mRNA相對表達量

圖1 兩種不同力竭運動后大鼠心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)PPARα mRNA相對表達量比較

2.3 PPARα蛋白表達

2.3.1 一次力竭運動

如表4所示，一次力竭游泳運動后12小時心臟竇房結(jié)PPARα蛋白表達顯著高于對照組和運動后4小時（P<0.05）。運動后即刻、12小時房室結(jié)PPARα蛋白表達顯著高于對照組 （P<0.01），4小時、24小時顯著低于運動后12小時（P<0.01）。運動后即刻、4小時、12小時浦肯野氏纖維PPARα蛋白表達顯著低于對照組（P<0.01），4 小時、12 小時顯著低于即刻（P<0.01），24小時顯著高于對照組和其他各時相組（P<0.01）。

一次力竭游泳運動后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)不同部位PPARα蛋白表達存有差異。運動后即刻竇房結(jié)PPARα蛋白表達顯著低于房室結(jié)（P<0.05）和浦肯野氏纖維（P<0.01），房室結(jié)顯著低于浦肯野氏纖維（P<0.01）。運動后12小時房室結(jié)顯著高于竇房結(jié)和浦肯野氏纖維（P<0.01）。運動后24小時浦肯野氏纖維顯著高于竇房結(jié)和房室結(jié)（P<0.01）。

總體看，一次力竭運動后傳導(dǎo)系統(tǒng)竇房結(jié)、房室結(jié)、浦肯野氏纖維PPARα蛋白表達在運動后4小時下降到低谷。房室結(jié)變化較明顯，出現(xiàn)兩個波峰。運動后浦肯野氏纖維PPARα蛋白表達明顯高于竇房結(jié)和房室結(jié)。

表4 一次力竭運動后大鼠PPARα蛋白表達灰度值變化

2.3.2 反復(fù)力竭運動

如表5所示，經(jīng)反復(fù)力竭游泳運動后，心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)竇房結(jié)、房室結(jié)PPARα蛋白表達即刻顯著高于對照組和其它各運動組（P<0.01）。

浦肯野氏纖維PPARα蛋白表達對照組顯著高于其它各運動組（P<0.01），即刻顯著高于 4、12、24小時（P<0.01）。

心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)不同部位在反復(fù)力竭游泳運動后存有差異。其中即刻，房室結(jié)PPARα蛋白表達顯著高于浦肯野氏纖維（P<0.05）。4小時和12小時，竇房結(jié)顯著低于房室結(jié)（P<0.05）和浦肯野氏纖維（P<0.01）。24小時，浦肯野氏纖維顯著高于竇房結(jié)和房室結(jié)（P<0.05）。

表5 反復(fù)力竭運動后大鼠PPARα蛋白表達灰度值變化

總體來看，反復(fù)力竭運動后傳導(dǎo)系統(tǒng)竇房結(jié)、房室結(jié)、浦肯野氏纖維PPARα蛋白表達規(guī)律基本一致。運動后4小時下降到低谷，其中，竇房結(jié)、房室結(jié)的變化較為明顯。

2.3.3 不同力竭方式運動后比較

圖2 兩種不同力竭運動后大鼠心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)PPARα蛋白表達比較

如圖2所示，反復(fù)力竭后即刻心臟竇房結(jié)PPARα蛋白表達顯著高于一次力竭后即刻 （P<0.01），反復(fù)力竭后12小時顯著低于一次力竭后12小時（P<0.01），其他時相組間無明顯差異（P>0.05）。兩種不同方式力竭運動后心臟房室結(jié)PPARα蛋白表達有差異，反復(fù)力竭后即刻顯著高于一次力竭后即刻（P<0.01），反復(fù)力竭后12小時顯著低于一次力竭后12小時（P<0.01），其他時相組間無明顯差異（P>0.05）。兩種不同方式力竭運動后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)浦肯野氏纖維PPARα蛋白表達有差異，反復(fù)力竭后24小時顯著低于一次力竭后24小時（P<0.01），其他時相組間無明顯差異（P>0.05）。

3 討論

過氧化體增殖物激活型受體（peroxisome proliferator-activated receptor，PPARs）是一種致密分子構(gòu)成的類固醇受體超家族核受體，有PPARα、PPARβ和 PPARγ3 種亞型［6］。與其它核受體一樣，PPARα 在代謝旺盛的組織表達極為豐富，在肝細胞、心肌細胞、腸細胞及腎近曲小管細胞呈高水平表達。其主要功能為介導(dǎo)與脂肪酸氧化有關(guān)的基因的活化，使體內(nèi)脂肪酸氧化/甘油酯化平衡趨向于分解代謝途徑；參與調(diào)節(jié)炎癥過程［7］。有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌缺血缺氧時，脂肪酸氧化減少，葡萄糖氧化增加，減少心肌氧耗，增加心肌對缺血和缺氧的耐受性，阻止細胞凋亡，認為這種能量代謝轉(zhuǎn)換可能具有一定的心肌保護作用［8］。心肌線粒體大部分編碼脂肪酸氧化酶核基因的表達是由PPARα調(diào)控的，心肌的這種保護作用是通過下調(diào)PPARα表達實現(xiàn)的［9］。一旦心肌灌注恢復(fù)，PPARα表達未及時恢復(fù)，雖然氧供應(yīng)充足，但脂肪酸氧化未增加，心肌能量供應(yīng)相對不足，對缺血再灌注的心肌恢復(fù)也是不利的［10，11］。 有研究發(fā)現(xiàn)，實驗性缺血再灌注大鼠心肌PPARα表達減少，同時伴有血清游離脂肪酸增多。還有文獻報道，PPARα在心臟還發(fā)揮抗炎作用［12］，對心臟有保護作用，PPARα激動劑可抑制由脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子α和核因子κB在心肌的基因表達，提示PPARα激動劑可能通過調(diào)控炎癥因子發(fā)揮抗炎作用，減少心肌受損。

PPARα是心肌脂質(zhì)和能量代謝的重要調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控出生后心肌線粒體編碼脂肪酸β氧化（FAO）酶的大部分核基因表達［13］。研究表明，缺氧時PPARα失活，隨之下調(diào)FAO酶基因表達。本研究發(fā)現(xiàn)，一次力竭運動后竇房結(jié)PPARα mRNA與蛋白表達呈先下降后升高的趨勢。分析認為，一次力竭運動導(dǎo)致竇房結(jié)急性缺氧，PPARα失活，F(xiàn)AO酶基因表達下調(diào)，進而使脂肪酸β氧化受到抑制，產(chǎn)能減少。竇房結(jié)細胞供能障礙，引起細胞結(jié)構(gòu)和功能的改變，進而引起竇房結(jié)起搏和傳導(dǎo)功能受限，構(gòu)成運動性心律失常的發(fā)生機制。隨力竭運動后恢復(fù)時間的延長，PPARα活性逐漸恢復(fù)。反復(fù)力竭運動后竇房結(jié)PPARα mRNA與蛋白表達呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，運動后即刻PPARα代償性升高，有氧氧化代償性加快，之后隨著缺血再灌注加重竇房結(jié)損傷，引起PPARα表達相對下降，竇房結(jié)細胞嚴重損傷，且恢復(fù)緩慢，至24小時有所回升，且反復(fù)力竭后回升速度顯著低于一次力竭。這提示反復(fù)力竭運動對竇房結(jié)的影響較重，可能增加運動性心律失常的發(fā)生幾率。

本研究發(fā)現(xiàn)，一次力竭運動后房室結(jié)PPARα mRNA和蛋白表達出現(xiàn)兩個波峰。一次力竭運動后即刻PPARα代償性增加，脂肪酸氧化增強，供能增加。隨著缺氧的加重，PPARα活性逐漸降低，曲線下降。氧供恢復(fù)后，PPARα大量被激活，有氧氧化能力增強，產(chǎn)能增加。故曲線有所波動。反復(fù)力竭運動后呈先升高后下降的趨勢。反復(fù)力竭運動后呈PPARα代償性增加，脂肪酸氧化增強，能量代償性增加，隨恢復(fù)時間的延長，能量消耗增加，致使缺氧加重，PPARα失活，曲線下降。PPARα表達未及時恢復(fù)，雖然氧供應(yīng)充足，但脂肪酸氧化并未增加，心肌能量供應(yīng)相對不足。

心肌缺血缺氧時，能量代謝障礙是造成缺血心肌損傷的主要因素［14，15］。 心臟是高氧耗的器官，一旦缺血缺氧，心肌細胞迅速由有氧代謝轉(zhuǎn)為無氧代謝。本研究發(fā)現(xiàn)，一次力竭運動后浦肯野氏纖維PPARα mRNA和蛋白表達呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢，運動后24小時升高最明顯。一次力竭運動后PPARα表達失活，可使FAO酶基因表達下調(diào)，脂肪酸β氧化受到抑制，產(chǎn)能減少。浦肯野氏纖維細胞供能障礙，可能引起心室內(nèi)興奮傳導(dǎo)異常。隨著運動后恢復(fù)時間的延長，PPARα表達被激活，功能逐漸恢復(fù)。反復(fù)力竭運動后呈下降趨勢，運動后4小時明顯下降一直持續(xù)到24小時，且運動后4小時、12小時、24小時均顯著低于對照組和運動后即刻。反復(fù)力竭刺激引起PPARα表達持續(xù)失活，脂肪酸β氧化持續(xù)受到抑制，產(chǎn)能障礙。反復(fù)力竭運動后浦肯野氏纖維能量代謝嚴重不足，其各種功能均受到抑制，室性心律失常發(fā)生率大為增加，嚴重者可能導(dǎo)致心力衰竭。

4 小結(jié)

4.1 力竭運動后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)各部位能量代謝調(diào)控因子PPARα在mRNA和蛋白水平出現(xiàn)異常低表達，易引起傳導(dǎo)系統(tǒng)能量代謝障礙，構(gòu)成運動性心律失常的病理過程和發(fā)生機制。

4.2 力竭運動后傳導(dǎo)系統(tǒng)各部位PPARα mRNA和蛋白表達有時相規(guī)律，不同力竭運動后竇房結(jié)、房室結(jié)、浦肯野氏纖維PPARα mRNA和蛋白表達均在運動后4小時降至低谷。

4.3 力竭運動后傳導(dǎo)系統(tǒng)不同部位PPARα mRNA和蛋白表達存在差異，竇房結(jié)PPARα在mRNA和蛋白異常低表達變化規(guī)律基本一致，呈持續(xù)性低表達，房室結(jié)在12小時有所波動，而浦肯野氏纖維在一次力竭運動后24小時PPARα在mRNA和蛋白低表達狀況有恢復(fù)趨勢，進一步提示反復(fù)力竭運動對心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)的影響更為明顯。

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