耐力運(yùn)動(dòng)促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞線粒體能量代謝及其對(duì)成肌分化的影響

薄海 王遜 陳啟祥 吉力立 3， 張勇 ，1

1軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所（天津 300050） 2天津體育學(xué)院天津市運(yùn)動(dòng)生理學(xué)與運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（天津 300381） 3明尼蘇達(dá)大學(xué)運(yùn)動(dòng)科學(xué)系，MN 55455，美國(guó) 4武警后勤學(xué)院部隊(duì)訓(xùn)練醫(yī)學(xué)教研室（天津 300162）

骨骼肌具有高度可塑性，適當(dāng)運(yùn)動(dòng)能夠有效促進(jìn)肌肉肥大，從而提高肌肉工作能力。肌肉發(fā)生是肌肉肥大的重要生物學(xué)基礎(chǔ)，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞（satellite cells）在成體肌肉發(fā)生過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。衛(wèi)星細(xì)胞具有自我更新、增殖和分化特性，被定義為肌肉干細(xì)胞。衛(wèi)星細(xì)胞在MyoD等成肌調(diào)節(jié)因子作用下成肌分化（myogenic differentiation）為肌管，不僅能與原有肌纖維融合，修復(fù)或強(qiáng)化肌肉結(jié)構(gòu)，還能形成新的肌纖維［1］。研究表明，一次性運(yùn)動(dòng)可激活衛(wèi)星細(xì)胞，促進(jìn)增殖使其數(shù)量增加；多次重復(fù)運(yùn)動(dòng)可提高其成肌分化能力［2］。

Charifi等［3］發(fā)現(xiàn)，14 周跑臺(tái)訓(xùn)練顯著增加骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量、肌纖維中的肌核數(shù)量及肌纖維橫截面積。成熟肌纖維中的肌核是不能分裂的，因而增加的肌核來(lái)源于分化的衛(wèi)星細(xì)胞。Shefer等［4］則發(fā)現(xiàn)，2周跑臺(tái)訓(xùn)練可顯著提高骨骼肌MyoD、Myf5等成肌分化標(biāo)志因子表達(dá)。以上結(jié)果表明耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可提高衛(wèi)星細(xì)胞分化能力。運(yùn)動(dòng)對(duì)衛(wèi)星細(xì)胞的作用機(jī)制一般認(rèn)為與其“微環(huán)境”變化有關(guān)，如肌肉微損傷誘發(fā)炎癥反應(yīng)、肌纖維旁分泌IGF-1、MGF等生長(zhǎng)因子［5］。但衛(wèi)星細(xì)胞內(nèi)組分對(duì)運(yùn)動(dòng)的應(yīng)答機(jī)制缺乏研究。

衛(wèi)星細(xì)胞增殖與分化是兩個(gè)矛盾的過(guò)程，增殖是細(xì)胞周期循環(huán)的過(guò)程，而分化是使細(xì)胞不可逆地退出細(xì)胞周期。增殖狀態(tài)衛(wèi)星細(xì)胞線粒體含量很少，其能量代謝以無(wú)氧糖酵解為主；當(dāng)其進(jìn)入成肌分化階段，線粒體有氧代謝逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)以適應(yīng)成熟肌細(xì)胞的生理功能［6］。研究表明，線粒體DNA拷貝數(shù)、呼吸鏈復(fù)合體表達(dá)及線粒體氧化磷酸化水平在成肌分化過(guò)程中進(jìn)行性增加［7］。 此外，Jahnke 等［8］發(fā)現(xiàn)，線粒體生物合成可通過(guò)影響胞漿鈣離子濃度逆向調(diào)控成肌細(xì)胞細(xì)胞周期。上述結(jié)果提示線粒體數(shù)量和質(zhì)量參與調(diào)控衛(wèi)星細(xì)胞分化的啟動(dòng)和進(jìn)程。我們推測(cè)，運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)影響衛(wèi)星細(xì)胞線粒體能量代謝以調(diào)控成肌分化。

本研究建立了小鼠中等負(fù)荷耐力訓(xùn)練模型，并分離骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，觀察反復(fù)運(yùn)動(dòng)刺激對(duì)未分化衛(wèi)星細(xì)胞中線粒體能量代謝的影響；并在體外誘導(dǎo)分化，探討運(yùn)動(dòng)干預(yù)后衛(wèi)星細(xì)胞分化過(guò)程中線粒體能量代謝的變化規(guī)律，及其對(duì)成肌分化能力的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

雄性C57BL/6小鼠24只，體重18～20g，2月齡，由北京華阜康生科技股份有限公司提供，生產(chǎn)許可證：SCKK（京）2009-0004，生產(chǎn)批號(hào)：1003428，級(jí)別SPF級(jí)。分籠飼養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食，飼養(yǎng)溫度21～24℃，相對(duì)濕度45～55%。將小鼠隨機(jī)分為2組：安靜對(duì)照組（N 組，n=12）和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組（T 組，n=12），組間體重?zé)o顯著性差異。T組小鼠置于小動(dòng)物跑臺(tái)中，進(jìn)行中等負(fù)荷耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，即0°，17 m/min（相當(dāng)于 65%VO2max），每天 1次，每次 1 h，每周 5次，共12周。該運(yùn)動(dòng)模型已被證明可促進(jìn)小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞活化，肌纖維內(nèi)肌核增加［9］。N組小鼠每日置于靜止跑臺(tái)1 h。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)、取材及指標(biāo)測(cè)定均在天津體育學(xué)院天津市運(yùn)動(dòng)生理學(xué)與運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：天津體育學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室：（津）2005-0006。

1.2 骨骼肌形態(tài)學(xué)觀察

末次訓(xùn)練后24 h，記錄小鼠體重，脫頸處死，完整切取小鼠單側(cè)腓腸肌，稱(chēng)量濕重。將其橫向切斷，浸泡于10%甲醛中固定48 h，常規(guī)石蠟包埋，肌肉橫切面切片，厚度8 μm，常規(guī)HE染色。BI-2000型圖像分析系統(tǒng)測(cè)量肌纖維橫截面積。

1.3 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞原代培養(yǎng)

為了提高原代培養(yǎng)衛(wèi)星細(xì)胞產(chǎn)量，減少體外增殖時(shí)間，本研究將2只小鼠作為一個(gè)樣本提取衛(wèi)星細(xì)胞并測(cè)定相關(guān)指標(biāo)，最終N組和T組樣本量均為6。將1.2中已處死并切除單側(cè)腓腸肌的小鼠整體浸泡于75%酒精中15分鐘消毒。無(wú)菌條件下取小鼠雙下肢剩余肌肉（股四頭肌、比目魚(yú)肌、腓腸肌），剔除脂肪筋膜和血管，PBS漂洗3遍。將組織塊剪為肉糜，再用PBS沖洗3次，靜置1 min后，棄去漂浮組織和上層液體。加入5倍體積0.1%Ⅱ型膠原蛋白酶，37℃在磁力攪拌器慢速攪拌下消化90 min。800g離心10分鐘，吸除上清液，加入5倍體積0.25%胰蛋白酶，37℃在磁力攪拌器慢速攪拌下消化10 min后，加入10%胎牛血清1ml終止消化。1000g離心10分鐘，吸除上清液，加入5ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基 （高糖DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，2%馬血清，100 U/ml青霉素+鏈霉素），反復(fù)吹打后依次通過(guò)100目、200目和400目不銹鋼細(xì)胞篩過(guò)濾。細(xì)胞懸液加入100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，采用差速貼壁法除去成纖維細(xì)胞，先將細(xì)胞在37℃溫箱中培養(yǎng)2 h，吸取未貼壁的細(xì)胞懸液，以105/ml左右的細(xì)胞密度接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，放于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后首次換液，以后每48 h換液1次。免疫化學(xué)染色方法鑒定骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的肌源性標(biāo)志結(jié)蛋白desmin的表達(dá)。

1.4 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化培養(yǎng)

當(dāng)細(xì)胞增殖至80%融合時(shí)，棄去生長(zhǎng)培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，加入分化培養(yǎng)基（高糖DMEM培養(yǎng)基，2%馬血清，100 U/ml青霉素+鏈霉素）繼續(xù)培養(yǎng)，倒置顯微鏡拍照各組細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)。各組細(xì)胞分別于分化0 h和24 h收集細(xì)胞，0.25%胰酶消化，消化完全后加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基終止消化，800g離心10分鐘，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定細(xì)胞總蛋白含量。

1.5 線粒體呼吸功能測(cè)定

采用Oxygraph-2k細(xì)胞呼吸測(cè)量?jī)x（Oroboros，Austria）測(cè)定透膜細(xì)胞中線粒體氧耗速率［10］。反應(yīng)體系3 ml，37℃恒溫，以固定速度攪拌。細(xì)胞重懸于3 ml呼吸測(cè)定介質(zhì)（130 mM KCl，10 mM Hepes，1 mM EDTA，2.5 mM KH2PO4，1.5 mg defatted BSA，pH 7.4），加入10 μM洋地黃皂甙透膜3 min。穩(wěn)定后加入5 mM蘋(píng)果酸和10 mM谷氨酸啟動(dòng)態(tài)4呼吸。平穩(wěn)后加入5 mM ADP啟動(dòng)態(tài)3呼吸。ADP耗盡后重又回到態(tài)4呼吸。記錄儀記錄耗氧曲線。計(jì)算態(tài)3（State 3，ST3）和態(tài) 4（State 4，ST4）呼吸速率（nmol O2/min·mg pro）和呼吸控制比（RCR）。

1.6 ATP合成活力測(cè)定

采用熒光素-熒光素酶發(fā)光法［11］，用 20/20n型發(fā)光儀（Turner Biosystem，USA）測(cè)定ATP合成活力。細(xì)胞重懸于0.5 ml測(cè)定介質(zhì) （0.5 mM EDTA，10 mM Hepes，5mM KH2PO4，2.5 mM MgCl2）中，加入 5 μM 洋地黃皂甙透膜3 min。加入20 μM熒光素酶、5 mM蘋(píng)果酸和10 mM谷氨酸，記錄發(fā)光強(qiáng)度變化率為本底，加入4 μM ADP后啟動(dòng)線粒體ATP合成反應(yīng)，記錄發(fā)光強(qiáng)度變化率。二者差值為線粒體ATP合成活力（nmol/min·mg pro）。

1.7 線粒體膜電位測(cè)定

采用JC-1熒光探針檢測(cè)線粒體膜電位［12］。將細(xì)胞重懸于0.9 ml JC-1染色工作液（碧云天生物公司），加入5 μM洋地黃皂甙透膜3 min。加入避光37℃水浴20 min。水浴后加入5 mM蘋(píng)果酸和10 mM谷氨酸啟動(dòng)態(tài)4呼吸，于熒光分光光度計(jì)（Beckman，USA）下測(cè)定綠色熒光 （激發(fā)波長(zhǎng)490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm）和紅色熒光（激發(fā)波長(zhǎng)525 nm，發(fā)射波長(zhǎng)590 nm）。用紅色熒光（聚合物）數(shù)值/綠色熒光（單體）數(shù)值表示線粒體膜電位。

1.8 Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

每個(gè)樣本收集5×106個(gè)細(xì)胞，加入5倍體積RIPA蛋白裂解液（碧云天生物公司），冰浴10 min，且每隔5 min在漩渦混合儀震蕩30秒。4℃12000g離心15min，將上清轉(zhuǎn)移至新離心管中，即得細(xì)胞總蛋白產(chǎn)物。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定提取蛋白濃度，分裝，-80℃保存。Western blot法檢測(cè)細(xì)胞MyHC、COXⅣ、AMPK、p-AMPK（Thr 172）和 p21 蛋白表達(dá)量，以β-tubulin作為內(nèi)參。取5×106細(xì)胞接種于100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，觀察細(xì)胞融合度為80%時(shí)進(jìn)行總蛋白的提取，將提取蛋白根據(jù)樣品濃度不同加入2×SDS上樣緩沖液，混合液100℃加熱5 min，冰浴冷卻。在垂直電泳儀（BIO-RAD，USA）上用 10 μg 蛋白質(zhì)樣品經(jīng)15%SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移于PVDF膜上。1∶1000一抗（Abcam）4℃靜置孵育過(guò)夜，洗滌3次，再以1∶1000辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育1小時(shí)，充分洗滌后，使用ECL試劑盒發(fā)光顯影，X線膠片壓片曝光，掃描定量各條帶的相對(duì)灰度值。以N組0 h條帶灰度值為100%，其他兩組條帶灰度值與N組0 h條帶灰度值的比值，即為其相對(duì)表達(dá)量（%）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 體重、腓腸肌濕重及肌纖維橫截面積

T組小鼠體重和N組比較無(wú)明顯差異（P>0.05）；T組腓腸肌濕重和濕重/體重比值略高于N組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，T組肌纖維橫截面積顯著高于 N 組（P<0.05）（表 1，圖 1）。

表1 兩組小鼠體重、腓腸肌濕重及肌纖維橫截面積比較

圖1 兩組（左為N組，右為T(mén)組）腓腸肌肌纖維橫截面積（×40）

2.2 原代培養(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞desmin免疫化學(xué)染色鑒定

免疫化學(xué)染色結(jié)果表明，原代培養(yǎng)的衛(wèi)星細(xì)胞呈現(xiàn)胞漿豐富的梭形或紡錘形細(xì)胞，經(jīng)計(jì)數(shù)，desmin抗體免疫化學(xué)染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)比例>90%（圖2）。Desmin在骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞胞漿中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，胞漿染色呈棕黃色，而成纖維細(xì)胞等雜質(zhì)細(xì)胞不著色。表明本研究原代培養(yǎng)的衛(wèi)星細(xì)胞純度較高，可滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。

圖2 原代培養(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞desmin免疫化學(xué)染色鑒定結(jié)果

圖3 兩組（左為N組，右為T(mén)組）骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化24 h 肌管形成情況（×100）。

2.3 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化能力

倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示，衛(wèi)星細(xì)胞誘導(dǎo)24 h后，T組大量衛(wèi)星細(xì)胞發(fā)生融合，并形成多核的肌管細(xì)胞（圖3右）。與T組比較，N組細(xì)胞融合和形成肌管的數(shù)量明顯減少 （圖3左）。Western-blot結(jié)果顯示，分化0 h時(shí)N組和T組MyHC表達(dá)組間比較無(wú)明顯差異（P>0.05）；分化24 h時(shí)，T組MyHC表達(dá)顯著高于N組 （P<0.05）。組內(nèi)比較，N組和T組24 h時(shí)MyHC 表達(dá)均顯著高于 0 h（P<0.01）（圖 4）。

圖4 兩組骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化中MyHC蛋白表達(dá)

2.4 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化中線粒體標(biāo)志蛋白COXⅣ表達(dá)

圖5 兩組骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化中COXⅣ蛋白表達(dá)

Western-blot結(jié)果（圖5）顯示，組間比較，分化0 h時(shí)N組和T組COXⅣ表達(dá)無(wú)明顯差異 （P>0.05）；分化24 h時(shí)，T組COXⅣ表達(dá)顯著高于N組 （P<0.05）。組內(nèi)比較，N組和T組24 h時(shí)COXⅣ表達(dá)均顯著高于 0 h（P<0.05）。

2.5 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化中線粒體能量代謝指標(biāo)（表2）

組間比較，0 h和 24 h時(shí)，T組 ST3、RCR和ATP合成活力均顯著高于N組（P<0.05）。0 h時(shí)T組膜電位較N組有升高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），24 h時(shí)T組膜電位顯著高于N組（P<0.05）。

組內(nèi)比較，N組和T組ST3、ST4表達(dá)在24 h時(shí)均顯著高于 0 h（P<0.05）。

2.6 兩組骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化中相關(guān)信號(hào)通路指標(biāo)

Western-blot結(jié)果（圖 6、7、8）顯示，組間比較，0 h和24 h時(shí)T組p21蛋白表達(dá)均顯著高于N組 （P<0.05），0 h和24 h時(shí)T組p-AMPK蛋白表達(dá)均顯著低于N組（P<0.05），兩組AMPK蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異（P>0.05）；組內(nèi)比較，N組和T組24 h時(shí)p21蛋白表達(dá)均顯著高于0 h（P<0.01），兩組24 h和0 h AMPK和p-AMPK無(wú)明顯差異（P>0.05）。

表2 兩組骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化中線粒體能量代謝指標(biāo)比較（n=6）

圖6 兩組骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化中AMPK蛋白表達(dá)

圖7 兩組骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化中p-AMPK蛋白表達(dá)

圖8 兩組骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化中p21蛋白表達(dá)

3 討論

本研究建立了小鼠中等負(fù)荷耐力訓(xùn)練模型，腓腸肌濕重/體重比值及肌纖維橫截面積結(jié)果顯示，所采用的運(yùn)動(dòng)模型有效促進(jìn)了骨骼肌肥大。衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化是肌肉肥大的生物學(xué)基礎(chǔ)之一。本研究分離了骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，原代培養(yǎng)并誘導(dǎo)成肌分化，結(jié)果表明，分化24 h后，與安靜組比較，運(yùn)動(dòng)組細(xì)胞融合及形成肌管的數(shù)量明顯增加，成肌分化標(biāo)志蛋白MyHC表達(dá)顯著升高。這表明耐力運(yùn)動(dòng)可通過(guò)提高衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化能力促進(jìn)肌肉肥大。值得注意的是，本研究中的衛(wèi)星細(xì)胞分化是在離體環(huán)境中進(jìn)行的，與在體“微環(huán)境”中的炎性物質(zhì)和生長(zhǎng)因子等無(wú)關(guān)。這表明反復(fù)運(yùn)動(dòng)刺激使衛(wèi)星細(xì)胞未分化時(shí)其細(xì)胞內(nèi)組分即發(fā)生改變，而這種“積累效應(yīng)”足以引起分化能力的差異。

研究者逐漸認(rèn)識(shí)到線粒體能量代謝是干細(xì)胞由增殖向分化切換的重要事件。Varum等［13］發(fā)現(xiàn)利用抗霉素A抑制線粒體復(fù)合體Ⅲ活性，有利于保持胚胎干細(xì)胞 （ESCs）自我更新?tīng)顟B(tài)和多潛能干性。Pietila等［14］利用流式細(xì)胞技術(shù)分揀JC-1標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs），發(fā)現(xiàn)線粒體膜電位高的hMSCs更傾向于分化，而膜電位低的hMSCs傾向于分裂增殖。本研究中，分化0 h時(shí)，與安靜組比較，運(yùn)動(dòng)組線粒體ST3顯著升高，ST4無(wú)明顯變化，因而RCR顯著升高。此外，線粒體ATP合成活力和膜電位均顯著升高。這表明耐力運(yùn)動(dòng)提高了未分化衛(wèi)星細(xì)胞中線粒體能量代謝水平。

本研究測(cè)量了透膜細(xì)胞線粒體的整體能量代謝水平，為探討其變化是否與線粒體數(shù)量有關(guān)，我們檢測(cè)了線粒體標(biāo)志蛋白COXⅣ表達(dá)量。結(jié)果表明，分化0 h時(shí)，運(yùn)動(dòng)組COXⅣ表達(dá)與安靜組無(wú)明顯差異，因而線粒體能量代謝上調(diào)與線粒體數(shù)量無(wú)關(guān)。RCR升高表明線粒體偶聯(lián)程度增加。Chen等［15］發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)解偶聯(lián)蛋白2（UCP2）使C2C12成肌細(xì)胞保持于增殖狀態(tài)而抑制分化，成肌調(diào)節(jié)因子MyoD可通過(guò)上調(diào)肌肉特異性Micro RNA-113a抑制成肌細(xì)胞UCP2表達(dá)，繼而促進(jìn)成肌分化。我們推測(cè)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可能通過(guò)MyoD途徑抑制衛(wèi)星細(xì)胞線粒體解偶聯(lián)呼吸。此外，Leiter等［16］發(fā)現(xiàn)，機(jī)械牽拉衛(wèi)星細(xì)胞可刺激一氧化氮（NO）產(chǎn)生。 最近 Palma 等［11］發(fā)現(xiàn)，NO 可通過(guò)抑制Drp1介導(dǎo)的線粒體分裂促進(jìn)成肌分化。我們前期研究也證明，運(yùn)動(dòng)過(guò)程中骨骼肌線粒體趨向分裂時(shí)伴隨ST4增加，而線粒體趨向融合時(shí)則伴隨ST3和ATP合成活力和膜電位上調(diào)［17］。我們推測(cè)，NO途徑是運(yùn)動(dòng)上調(diào)衛(wèi)星細(xì)胞線粒體能量代謝的潛在途徑。

衛(wèi)星細(xì)胞從增殖階段向分化階段轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟即細(xì)胞周期的退出。細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶抑制因子p21蛋白已被證明可通過(guò)阻止衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)入S期以啟動(dòng)分化，p21敲除鼠骨骼肌修復(fù)和再生能力明顯降低，表現(xiàn)為肌萎縮［18］。Williamson等發(fā)現(xiàn)，AMPK激動(dòng)劑AICAR通過(guò)下調(diào)FOXO3A表達(dá)抑制其下游p21表達(dá)，從而抑制C2C12成肌細(xì)胞分化，作者認(rèn)為AMPK-p21途徑可能是成肌分化的能量檢測(cè)路徑［19］。AMPK是細(xì)胞能量變化感受器，AMP/ATP比值升高使AMPK激活。本研究中，分化0 h時(shí)，與安靜組比較，AMPK蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，而p-AMPK表達(dá)明顯減少，同時(shí)p21蛋白表達(dá)顯著升高。我們推測(cè)，耐力運(yùn)動(dòng)提高了未分化衛(wèi)星細(xì)胞線粒體能量代謝水平，從而抑制AMPK活化，繼而上調(diào)其下游p21表達(dá)，使衛(wèi)星細(xì)胞更易于啟動(dòng)分化。

為了進(jìn)一步探討運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的未分化衛(wèi)星細(xì)胞線粒體“積累效應(yīng)”對(duì)成肌分化的影響，本研究檢測(cè)了分化24 h時(shí)各組細(xì)胞線粒體能量代謝及相關(guān)通路的變化。與安靜組比較，運(yùn)動(dòng)組AMPK活化水平明顯降低，p21表達(dá)顯著升高。這表明AMPK-p21途徑在分化進(jìn)程中依然發(fā)揮效應(yīng)。與分化0 h比較，運(yùn)動(dòng)組 ST3（+136%）、ST4（+44%）、RCR（+75%）、ATP 合成活力（+240%）、膜電位（+105%）均顯著升高，安靜組 ST3（+107%）、ST4（+31%）、RCR（+61%）、ATP 合成活力（+221%）、膜電位（+95%）亦顯著升高。這些結(jié)果表明，運(yùn)動(dòng)組線粒體能量代謝指標(biāo)增加幅度均高于安靜組。此外，運(yùn)動(dòng)組COXⅣ和表達(dá)增加幅度亦高于安靜組（79%vs.66%）。以上提示，與安靜組比較，運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的高活性線粒體可在成肌分化中進(jìn)一步促進(jìn)線粒體能量代謝和生物合成。最近Lee等［20］研究發(fā)現(xiàn)，在成肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ可促進(jìn)線粒體能量代謝水平，同時(shí)增加活性氧（ROS）生成，促進(jìn)成肌分化；同時(shí)使用抗氧化劑反而抑制了分化。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，ROS可通過(guò)PGC-1α、Mfn1 等多條途徑上調(diào)線粒體能量代謝［17，21］。 我們推測(cè)，未分化衛(wèi)星細(xì)胞中高活性線粒體可能通過(guò)增加ROS生成，并激活其下游信號(hào)通路，進(jìn)一步促進(jìn)成肌分化中線粒體能量代謝。

4 總結(jié)

耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可提高未分化衛(wèi)星細(xì)胞線粒體能量代謝水平，繼而抑制AMPK活化而增加p21表達(dá)，從而促進(jìn)成肌分化啟動(dòng)；研究還提示，高活性線粒體可在成肌分化進(jìn)程中進(jìn)一步促進(jìn)線粒體能量代謝，繼而加速分化，具體機(jī)制有待研究。

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