低劑量氟化物對新生大鼠成骨細胞增殖的影響

丁文鵬,沈立明,何智慧

?

低劑量氟化物對新生大鼠成骨細胞增殖的影響

丁文鵬1, 2,沈立明1,何智慧2

(1. 深圳大學 生命科學學院, 廣東 深圳, 518000; 2. 深圳市庫源生物科技有限公司, 廣東 深圳, 518000)

氟是人體內(nèi)重要的微量元素之一,低劑量的氟化物作用成骨細胞與骨代謝關(guān)系密切. 成骨細胞活躍和骨轉(zhuǎn)換加速是氟骨癥的重要特征. 研究了氟化物對成骨細胞增殖以及細胞分裂周期的影響, 證實了低劑量的氟化物(2 mg/L)能引起體外培養(yǎng)的成骨細胞的細胞增殖并增加細胞分裂增殖的代數(shù).

氟化物; 大鼠; 成骨細胞; 增殖

氟是人體內(nèi)重要的微量元素之一. 在自然界的分布主要以螢石(CaF2)、冰晶石(Na3AlF6)和磷灰石(Ca5F(PO4)3)這三種礦物存在. 氟由胃腸道吸收入血液, 以離子形式分布到全身, 在機體內(nèi)與氫氧根離子或碳酸根離子交換, 形成穩(wěn)定的氟磷灰石, 沉積在骨和牙齒等組織. 氟與骨代謝關(guān)系一直是研究者最關(guān)注的領(lǐng)域[1-2], 易與鈣磷形成化合物滯留在骨骼內(nèi). 正常情況下, 氟在人體所占比例大致是恒定的, 體內(nèi)氟含量過高, 會導致氟骨癥. 它的發(fā)病機理還存在爭議[3]. 有研究表明氟化物對體外培養(yǎng)的成骨細胞存在低劑量促進生長增殖, 高劑量抑制生長的雙向調(diào)節(jié)作用[4]. 氟對體外培養(yǎng)成骨細胞促進增殖的有限濃度上限在10 mg/L左右[5], 超出這個劑量則超出細胞耐受范圍, 引起的細胞凋亡. 成骨細胞功能活躍在氟骨癥病變中是一個發(fā)生較早并起主導作用的環(huán)節(jié). 無論是骨硬化氟骨癥還是骨軟化氟骨癥都是在成骨細胞活動加強、骨轉(zhuǎn)換加速的情況下發(fā)生的. 成骨細胞活躍和骨轉(zhuǎn)換加速是氟骨癥的重要特征. 本研究采用低劑量的氟化物作用成骨細胞, 模擬氟骨癥中成骨細胞激活狀態(tài)[6], 研究了氟化物對成骨細胞增殖和細胞分裂的影響.

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

高速冷凍離心機(5417R, Eppendorf, 德國); 二氧化碳培養(yǎng)箱(香港力新); 倒置顯微鏡(CKX41, Olympus, 日本); 細胞流式儀(BC-032貝克曼庫爾特, 美國); SPF級SD大鼠(1～4 d, 廣東省動物中心提供); 胎牛血清(PAA, 奧地利); 胰蛋白酶(Sigma, 美國); αMEM培養(yǎng)基(Hyclone, 美國); CFSE細胞增殖檢測探針(Promega, 美國). PI試劑盒(貝克曼庫爾特, 美國); 其他試劑來源于正規(guī)公司, 溶液按照相關(guān)標準方法配制.

1.2 成骨細胞的分離和鑒定

取1～4 d新生SD乳鼠9只, 酒精浸泡片刻, 用含雙抗的D-Hank’s液清洗, 斷頸處死. 剝離結(jié)締組織和骨膜, 直到頭蓋骨呈現(xiàn)白色為止. 將頭蓋骨剪為1 mm2大小, 經(jīng)胰酶、Ⅱ型膠原酶等處理, 得到細胞懸液, 轉(zhuǎn)移到細胞培養(yǎng)瓶中. 當細胞長滿, 用0.25%胰酶消化, 分離成纖維細胞和成骨細胞, 得到較純的成骨細胞待用. 成骨細胞用Gomori鈣鈷改良法染色鑒定[7].

1.3 成骨細胞的增殖觀察與檢測

純化的成骨細胞按1×105個/mL接種到六孔板中, 隔天換液. 加入含2 mg/L NaF, 用αMEM培養(yǎng)基(10%血清)稀釋. 對照加入αMEM培養(yǎng)基(10%血清)作用48 h, 然后用倒置顯微鏡拍照觀察, 成骨細胞采用CFSE(Carbofluorescein Diacetate Succinimydil Ester)方法標記[8].

1.4 細胞周期的檢測

每個培養(yǎng)皿接種1 mL(細胞密度1×105個/mL左右), 待貼壁12 h后加入含2 mg/L NaF的αMEM培養(yǎng)基作用48 h(用不含NaF的一組作為空白對照). 胰酶消化收集細胞, 做成細胞懸液, 使密度在106個/mL左右, D-Hank’s洗一次, 按試劑盒操作. 加入PI工作液, 37℃避光孵育 30 min, 1500轉(zhuǎn)離心3 min, D-Hank’s洗一次, 上細胞流式儀檢測. 采用FL1通道, 共收集10 000個細胞, 用FCSExpress3.0軟件分析數(shù)據(jù).

2 結(jié)果與討論

2.1 成骨細胞的純化鑒定

酶消化得到成骨細胞為卵圓形, 高亮, 部分附著在骨膜網(wǎng)上. 在培養(yǎng)箱中靜置1～2 h后. 部分細胞貼壁. 36 h后換培養(yǎng)液時活細胞完全貼壁, 死細胞懸浮在培養(yǎng)液中. 純化后3天細胞為梭形、三角形, 或多邊形, 如圖1A所示. 原代培養(yǎng)第6天時, 鏡下觀察到細胞貼于瓶壁, 而且細胞變?yōu)樗笮? 兩極有長的突起, 相鄰細胞突起交織在一起. 第9天時, 細胞數(shù)量明顯增多, 細胞相互之間聯(lián)系密切, 部分出現(xiàn)重疊生長. 在細胞密集區(qū)可表現(xiàn)為放射狀、旋渦狀或柵欄狀. 細胞周圍開始變得暗淡, 可能是鈣沉積, 肉眼可見細胞爬片上有白色點狀物, 鏡下可見細胞集簇生長形成鈣化結(jié)節(jié). 如圖1(b)所示.

圖1 分離純化后的成骨細胞(×100)

在體外培養(yǎng)的成骨細胞仍保持較高的堿性磷酸酶活性, 經(jīng)Gomori染液作用后成骨細胞胞內(nèi)會出現(xiàn)黑色沉淀, 如圖2所示. 陰性對照的成纖維細胞少數(shù)或完全沒有著色, 而實驗組成骨細胞則呈陽性, 幾乎全部出現(xiàn)黑色沉淀.

圖2 細胞Gomori染色照片 (×200)

2.2 氟化物對成骨細胞的增殖影響

CFSE是一種可穿過細胞膜的熒光染料, 具有與細胞結(jié)合特異性的琥珀酰亞胺酯基團,與具有非酶促水解作用的羧基熒光素二醋酸鹽基團結(jié)合在一起,使CFSE 成為一種良好的細胞標記物. 分別將培養(yǎng)48 h后的2組細胞(對照組、實驗組含2 mg/L氟化鈉)CFSE染色. CFSE屬非極化分子, 能自動穿過細胞膜而進入胞內(nèi). 在胞內(nèi)酯酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)殛庪x子化CFSE, 與胞內(nèi)蛋白賴氨酸側(cè)鏈及可利用的氨基發(fā)生不可逆結(jié)合, 在靜止細胞內(nèi)經(jīng)約24 h平衡后, 能在胞內(nèi)保留數(shù)月, 且隨細胞分裂而減半. 由此從細胞發(fā)出熒光的強弱可間接反映成骨細胞分裂增殖快慢, 如圖3所示. 經(jīng)CFSE標記后, 空白對照的細胞熒光強, 細胞密度小, 實驗組的細胞熒光較弱, 細胞密度大.

當細胞被CFSE標記后, 細胞每分裂一次, 通過流式細胞儀在488 nm處進行熒光強度檢測時, 相應產(chǎn)生一個明顯可見的波峰. 細胞分裂多少次就有多少波峰, 而且分裂次數(shù)越多峰值會減小. 在圖形上反映出從左往右峰的數(shù)目增加但峰值會下降. 如圖4所示. 4(a)有2個波峰且其中一個波峰較大, 4(b)有5個波峰, 表明同樣培養(yǎng)48 h后, 無氟作用成骨細胞只有少數(shù)細胞分裂一次, 有兩代分裂細胞. 在2 mg/L氟化鈉作用48 h后, 成骨細胞分裂4次, 有5代分裂細胞. 在同樣的條件下染氟細胞分裂次數(shù)要多, 說明低劑量氟化鈉可促進成骨細胞的分裂增殖能力.

圖4 成骨細胞CFSE標記流式分析圖

2.3 氟化物成骨細胞周期的變化

細胞周期是指細胞從一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂結(jié)束的過程. 細胞周期反應了細胞增殖速度, 整個細胞周期經(jīng)歷分裂間期和有絲分裂期(M期). 分裂間期或生長期分為合成前期(G1)、DNA合成期(S)和合成后期(G2)實驗采用單PI標記法, 染氟濃度為4.76×10-5mg/L. 作用48 h, 發(fā)現(xiàn)氟作用的細胞S期和G2/M期都增加, 但G2/M期與對照組比較有統(tǒng)計學上的差異. 圖5為單PI標記的成骨細胞經(jīng)細胞流式儀檢測的細胞周期圖. 從圖5可以看到, 染氟48 h的細胞與對照組比較G0/G1期細胞減少, S期細胞增多, G2/M期細胞顯著增多. 表1顯示3次實驗統(tǒng)計數(shù)據(jù), 只有G2/M期有統(tǒng)計學差異(<0.05). G0/G1期、S期組間沒有統(tǒng)計學上的差異.

表1 新生SD大鼠成骨細胞染氟48h后各細胞周期的百分比

注:=3 (* 代表<0.05)

圖5 染氟48 h后成骨細胞周期變化圖

以上研究工作在細胞水平上證實了低劑量的氟化物(2 mg/L)確實能引起體外培養(yǎng)的成骨細胞的細胞增殖. CSFE標記可以直觀看到細胞分裂增殖的代數(shù), 細胞周期實驗發(fā)現(xiàn)氟化物能使成骨細胞的S期和G2/M期增加.

[1] Singh A. Endemic Fluorosis EpidemiologicaI and BlochemicaI Study of Chrouic fluofide Intoxication in Punjab[J]. Medcine, l963, 42: 229- 246．

[2] 萬桂敏, 莫志亞, 劉忠杰, 等. 地方性氟中毒患者多項檢驗指標的測定及分析[J]. 中國地方病防治雜志, 2001, 20(1): 137-139.

[3] 劉開泰. 氟對骨骼損傷的研究進展[J]. 地方病通報,1999, 14(2): 91-95.

[4] Fareley J R,Wergedal J E,Baylink D J. Fluoride directly stimulates p ro liferation and alkaline phosphatase activity of boneforming cells [J]. Science, 1983, 22: 330-332.

[5] 李廣生, 張文嵐, 華坤, 等. 慢性氟中毒時成骨細胞激活的機制[J]. 中國地方病雜志, 2003, 22(1): 10-13.

[6] 李廣生. 地方性氟中毒發(fā)病機制[M]. 北京: 科學出版社, 2004: 20-31.

[7] 王洪復. 骨細胞圖譜與骨細胞體外培養(yǎng)技術(shù)[M]. 上海: 上海科學技術(shù)出版社, 2000.

[8] Padureanu1 L, Cozmei C. Flow-cytometric analysis of specific proliferation in tuberculosis using the CFSE dye dilution technique[J]. J Prevent Med, 2003, 11(1): 67-74.

The influence of low dose of fluoride on the proliferation of neonatal rat osteoblasts

DING Wen-peng1, 2, SHEN Li-ming2, HE Zhi-hui2

(1. School of Life Sciences, Shenzhen University, Shenzhen 518000, China; 2. Shenzhen Coolrun Life Science, Shenzhen 518000, China)

Fluorine is one of the important trace elements in the human body, and closely related to bone metabolism. Osteoblast cell activity and bone turnover acceleration is an important characteristic of skeletal fluorosis. In this work, the impact of fluorinecompounds on osteoblast cell proliferation and cell division cycle was studied with low doses of fluoride. It was confirmed that low doses of fluoride (2 mg/L) can cause osteoblast cell proliferation in vitro and accelerate the proliferation of cell division algebra.

Fluoride; Rats; Osteoblasts; Proliferation

10.3969/j.issn.1672-6146.2012.03.013

Q 352

1672-6146(2012)03-0046-04

2012-07-30

丁文鵬(1980-), 男, 碩士, 從事生命科學研究. E-mail：dennishe@sdu.edu.cn

何智慧(1971-), 男, 研究員, 博士, 從事分析化學和生命科學研究工作. E-mail: dennishe1971@163.com

(責任編校:譚長貴)