流動(dòng)分析法測(cè)定煙草中蛋白質(zhì)含量前處理方法的改進(jìn)

李秋潼王 鵬尚 軍呂祥敏

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流動(dòng)分析法測(cè)定煙草中蛋白質(zhì)含量前處理方法的改進(jìn)

李秋潼1, 王 鵬1,2, 尚 軍1, 呂祥敏1

(1. 重慶煙草工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)部, 重慶, 400060; 2. 川渝中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心, 四川 成都, 610066)

為提高煙草中蛋白質(zhì)的分析速度, 對(duì)流動(dòng)分析法中蛋白質(zhì)的前處理過(guò)程進(jìn)行了改進(jìn), 即用萃取除可溶性氮代替加熱. 并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比較, 結(jié)果表明: 用萃取代替加熱在批量檢測(cè)時(shí)可大幅減少操作強(qiáng)度, 蛋白質(zhì)的回收率為94.9%～102.9% , 變異系數(shù)小于 2.77%; 檢測(cè)結(jié)果與文獻(xiàn)方法無(wú)顯著性差異, 可用于批量煙草樣品中蛋白質(zhì)含量的快速分析.

流動(dòng)分析法; 煙草; 蛋白質(zhì); 前處理

蛋白質(zhì)是煙草中的一種重要化合物, 但其在燃燒過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生苦味、辛辣味和刺激性, 也會(huì)產(chǎn)生如同羽毛燒焦的不良?xì)馕? 使煙草的吸味品質(zhì)變差[1]. 因此, 快速、準(zhǔn)確地測(cè)定煙草中的蛋白質(zhì)對(duì)煙草品質(zhì)的評(píng)價(jià)有重要意義. 目前, 煙草中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定主要采用的是流動(dòng)分析法[2], 但其前處理過(guò)程煩瑣復(fù)雜、費(fèi)時(shí), 不利于樣品的批量檢測(cè). 所以, 本文對(duì)測(cè)定煙草中蛋白質(zhì)含量的流動(dòng)分析法的前處理過(guò)程進(jìn)行了改進(jìn), 以便簡(jiǎn)化操作, 提高檢測(cè)效率.

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用試劑: 98%濃硫酸、酒石酸銻鉀、氯化鈉(成都化學(xué)試劑廠)、紅色氧化汞(貴州汞礦汞產(chǎn)品系列公司)、次氯酸鈉、磷酸氫二鈉、硫酸銨(重慶北碚化學(xué)試劑廠)、亞硝基鐵氰化鈉、水楊酸鈉(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)、氫氧化鈉(重慶川東化學(xué)有限公司)、Brij35(聚乙氧基月桂醚, 荷蘭SKALAR公司), 以上試劑均為分析純. 主要儀器: SKALAR流動(dòng)分析儀(荷蘭SKALAR公司)、AX504分析天平(瑞士梅特勒公司)、98-1-B型電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司).

1.2 方法

1.2.1 改進(jìn)的試驗(yàn)依據(jù)

文獻(xiàn)[2]樣品的前處理方法是: 稱取約0.5 g樣品于錐形瓶中, 加入0.5%(體積分?jǐn)?shù), 下同)乙酸溶液25 mL, 加熱微沸15 min. 其目的是在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的條件下, 去除非蛋白質(zhì)可溶性含氮物等干擾物質(zhì), 再消化處理, 檢測(cè)其中的含氮量. 根據(jù)蛋白質(zhì)與含氮量的關(guān)系, 反推出樣品中的蛋白質(zhì)含量. 因?yàn)樾枰訜岵⒖刂萍訜岢潭? 而目前常用的加熱裝置電爐或加熱套, 只能單獨(dú)對(duì)一個(gè)樣品進(jìn)行操作, 控溫效果也較差, 這制約了該方法在大批量樣品檢測(cè)中的應(yīng)用. 故, 找到一種處理方法代替其中的加熱環(huán)節(jié), 就可大大提高樣品的檢測(cè)量, 實(shí)際工作中應(yīng)用起來(lái)也更方便. 因此本文就此進(jìn)行了一些研究, 同樣利用蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的性質(zhì), 采用樣品萃取后靜置, 將干擾物質(zhì)完全萃取進(jìn)溶液中, 代替加熱試驗(yàn), 這既可將非蛋白質(zhì)可溶性氮分離, 又能將可溶性蛋白質(zhì)沉淀[3-5], 達(dá)到準(zhǔn)確測(cè)定煙草樣品中的蛋白質(zhì), 使批量樣品檢測(cè)更容易.

1.2.2 改進(jìn)后樣品的處理

準(zhǔn)確稱取約0.500 0 g 樣品, 置于100 mL錐形瓶, 加入0.5%的乙酸溶液50 mL, 于搖床上萃取30 min, 靜置12 h以上, 再用定量濾紙抽濾, 并用0.5%的乙酸溶液沖洗錐形瓶和濾渣至濾液無(wú)色, 再將濾紙和濾渣同時(shí)放入已加入0.1 g氧化汞和1 g硫酸鉀的消化管中, 向消化管中加入5 mL濃硫酸, 最后把消化管放入已設(shè)定溫度為150 ℃(置1 h)、370 ℃(置4 h)的消化器中消化. 消化結(jié)束后, 待消化管冷卻至室溫后, 用蒸餾水定容到100 mL, 再用流動(dòng)分析儀檢測(cè)樣品液中的氮含量, 進(jìn)而得出煙草樣品中的蛋白質(zhì)含量.

1.2.3 改進(jìn)方法的標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取0.943 g硫酸銨, 用蒸餾水溶解, 稀釋, 并定容到100 mL, 得到氮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液, 含量為2 mg/mL. 移取2、4、6、8、10 mL氮的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液, 用4%硫酸溶液稀釋并定容到100 mL, 搖勻, 得到氮標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度分別為0.04、0.08、0.12、0.16和0.20 mg/mL, 轉(zhuǎn)換成蛋白質(zhì)為: 0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mg/mL.

圖1 工作曲線

1.2.4 改進(jìn)方法的精密度測(cè)定

對(duì)3個(gè)樣品分別用改進(jìn)后的方法進(jìn)行前處理, 并分別進(jìn)行5次平行測(cè)定, 分析該方法測(cè)定蛋白質(zhì)的精密度.

1.2.5 改進(jìn)方法的準(zhǔn)確度測(cè)定

稱取已知蛋白質(zhì)含量的煙草樣品, 按3個(gè)比例加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì), 分別測(cè)定2次, 計(jì)算回收率, 分析該方法測(cè)定蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確度.

1.2.6 改進(jìn)方法與文獻(xiàn)[2]方法測(cè)定結(jié)果的比較

用改進(jìn)方法制備待測(cè)液, 進(jìn)行蛋白質(zhì)的測(cè)定, 同時(shí)用文獻(xiàn)方法測(cè)定, 并比較測(cè)定結(jié)果.

2 結(jié)果與分析

2.1 改進(jìn)方法標(biāo)準(zhǔn)曲線

應(yīng)用流動(dòng)分析儀測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液中蛋白質(zhì)的含量, 并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的電信號(hào)響應(yīng)值與其濃度進(jìn)行線性回歸, 得到其工作曲線見(jiàn)圖1, 其回歸方程為:= 71 270–555.7, 相關(guān)系數(shù)= 0.999, 式中,為電信號(hào)響應(yīng)值峰高(DU),為蛋白質(zhì)含量(mg/mL).

測(cè)空白試樣, 計(jì)算得到蛋白質(zhì)的檢測(cè)限為0.12 mg/mL. 能夠看出, 蛋白質(zhì)的濃度在0.25～1.25 mg/mL范圍內(nèi), 工作曲線線性較好, 適合于定量分析.

2.2 改進(jìn)方法的精密度分析

用本法對(duì)3個(gè)煙草樣品中的蛋白質(zhì)含量分別測(cè)定5次. 結(jié)果(表1)顯示, 檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)量(RSD)均小于2.77%, 說(shuō)明本方法具有比較好的重復(fù)性.

表1 蛋白質(zhì)測(cè)量的重復(fù)性檢驗(yàn)

2.3 改進(jìn)方法的準(zhǔn)確度分析

向煙草樣品中加入蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì), 測(cè)定回收率. 結(jié)果(表2)顯示, 蛋白質(zhì)的回收率在94.9%~ 102.9%之間, 表明本法測(cè)定的結(jié)果比較準(zhǔn)確.

表2 蛋白質(zhì)的回收率

2.4 改進(jìn)方法與文獻(xiàn)[2]方法的比較分析

用本方法和文獻(xiàn)[2]方法同時(shí)分別測(cè)定15個(gè)煙草樣品中的蛋白質(zhì)含量, 結(jié)果見(jiàn)表3. 對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn), 在0.05的顯著水平下, 兩種方法的檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有顯著差異, 表明本法適合煙草中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定.

表3 兩種方法測(cè)定的部分煙草樣品蛋白質(zhì)含量/(mg×g-1)

3 小結(jié)

研究表明: 在用連續(xù)流動(dòng)法測(cè)定煙草中蛋白質(zhì)含量時(shí), 利用萃取后靜置過(guò)夜, 除煙草中非蛋白質(zhì)可溶性氮, 代替文獻(xiàn)的加熱環(huán)節(jié)的方法是可行的. 通過(guò)前處理方法的改進(jìn)使操作簡(jiǎn)便, 回收率高, 重復(fù)性好, 適合煙草樣品中蛋白質(zhì)含量的批量快速分析, 適合應(yīng)用于實(shí)際工作中.

[1] 同克玉. 煙草化學(xué)[M]. 鄭州: 鄭州大學(xué)出版社, 2002: 106, 259-261.

[2] 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). YC/T249-2008 煙草及煙草制品蛋白質(zhì)的測(cè)定連續(xù)流動(dòng)法[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化出版社, 2008.

[3] 汪長(zhǎng)國(guó), 戴亞, 方力, 等.煙草中蛋白質(zhì)測(cè)定方法的改進(jìn)[J]. 煙草科技, 2004(1): 19-20, 35.

[4] 張槐苓, 葛翠英, 穆懷靜, 等. 煙草分析與檢驗(yàn)[M]. 鄭州: 河南科學(xué)技術(shù)出版社, 1994. 139-140.

[5] 王鵬, 呂祥敏, 戴亞. 流動(dòng)分析法測(cè)定煙草中的不溶性氮和可溶性氮[J]. 煙草科技, 2006(3): 38-40.

Improvement on preparation for proteindetermining in tobacco with enzymolysis-autoanalyzer

LI Qiu-tong1, WANG Peng1,2, SHANG Jun1, LV Xiang-ming1

(1. Chongqing Tobacco Industrial Co., Ltd.,Chongqing 400060,China; 2. China Tobacco Chuanyu Industrial Corporation, Chengdu 610066, China)

The preparation for enzymolysis-Autoanalyzer of protein in tobacco was improved to increase the analytic rate, extraction instead of heating. The results from extraction separation and heating were compared. The results indicated that, instead of heating using extraction separation can be a substantial increase in volume of tobacco sample pretreatment rate, the average recovery of starch was 94.9%~102.9%, RSD < 2.77%. And the test results with the original method was no significant difference, It could be applied in bulk tobacco samples rapid analysis of protein in tobacco.

enzymolysis-autoanalyzer; tobacco; protein; preparation

10.3969/j.issn.1672-6146.2012.03.016

TS 41+1

1672-6146(2012)03-0057-03

2012-05-21

李秋潼(1981-), 女, 工程師, 主要從事卷煙物理和煙草化學(xué)成分檢測(cè).E-mail:qiutong_116@163.com

王鵬(1979-), 男, 工程師, 主要從事卷煙物理指標(biāo)檢測(cè)研究. E-mail: wpglj@163.com

(責(zé)任編校:江 河)