地木耳總黃酮提取及抑菌作用

厲榮玉，錢森和，董 群，劉 輝

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002;2.安徽工程大學(xué) 生物技術(shù)教研室，安徽 蕪湖241000)

地木耳，學(xué)名普通念珠藻(Nostoccommune)，別名地皮菜、地軟、地耳、地踏菜等，屬藍(lán)藻門(Cyanophyta)，藍(lán)藻綱(Cyanophyceae)，念珠藻目(Nostoccales)，念珠藻科(Nostocaceae)，念珠藻屬(Nostoc)中的Nostoc communeVauch，為藍(lán)藻科念珠藻屬的片狀藻類和真菌的復(fù)合體［1］。

研究表明，地木耳富含蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗纖維、礦物質(zhì)、維生素、氨基酸、藍(lán)藻素、多糖等各種營(yíng)養(yǎng)成分［2－4］。近年來，人們發(fā)現(xiàn)地木耳細(xì)胞提取物中具有生物活性的物質(zhì)，其提取液對(duì)蛋白酶活性、人鼻咽癌細(xì)胞、直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和真菌均有抑制作用［5－6］。據(jù)張威［7］(2007)初步研究發(fā)現(xiàn)，地木耳中含有粗多酚及粗黃酮類物質(zhì)，具有一定的抗氧化和抗腫瘤活性，可以作為一種良好的天然抗氧化劑及抗腫瘤活性物質(zhì)來源。目前，對(duì)地木耳中活性物質(zhì)研究較多的為水溶性多糖提取，有關(guān)地木耳黃酮類化合物生物活性物質(zhì)的提取研究較少。為此，本文通過單因素和正交試驗(yàn)對(duì)地木耳總黃酮提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化;并以提取液對(duì)常見的幾種微生物進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)，旨在為地木耳總黃酮在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 地木耳采購(gòu)于蕪湖市神山口菜市場(chǎng)，用蒸餾水洗凈后，晾干保存?zhèn)溆?蘆丁對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司，其他試劑均為分析純。試驗(yàn)所需的主要儀器有TU-1800型紫外-可見分光光度計(jì)，RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，2K-82B型電熱恒溫真空干燥箱，HH-6型電熱恒溫水浴鍋，SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)等。

1.2 供試菌種 供試菌種分別為:大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、黑曲霉(Aspergillusniger)和白假絲酵母菌(Moniliaalbican)。以上供試菌種均為皖南醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基。

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［8］精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品24.3 mg，用30%乙醇溶液溶解后轉(zhuǎn)移到100 ml容量瓶中定容，配制成0.243 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml于25 ml容量瓶中，并用30%乙醇補(bǔ)充至12.5 ml，加入 0.05%NaNO30.56 ml，搖勻后放置 5 min，再加入 0.1%Al(NO3)30.56 ml，搖勻后放置5 min，再加入4 ml 1 mol/L NaOH溶液。混勻后用30%乙醇溶液定容。靜置15min后，在500 nm波長(zhǎng)下分別測(cè)定吸光度(A)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程Y=1.136X+0.0045，R2=0.9967。

1.3.3 地木耳粗黃酮的提取 將地木耳曬干后粉碎，過40目篩得其粉末;取其粉末5 g置于100 ml圓底燒瓶中，在一定的乙醇濃度、料液比、水浴溫度、浸提時(shí)間條件下進(jìn)行浸提，結(jié)束后，立刻抽濾并收集濾液;以同樣方法處理濾渣數(shù)次，抽濾并合并濾液，冷卻至室溫后，10 000 r/min離心10 min，除去少量葉綠素及其他水不溶性雜質(zhì)，上清液定容后作為待測(cè)液。檢測(cè)后剩余提取液蒸發(fā)濃縮，干燥后得到地木耳總黃酮粗樣品粉末。

1.3.4 黃酮含量的測(cè)定 取待測(cè)液10 ml于25 ml容量瓶中，加入30% 乙醇溶液2.5 ml使其體積為12.5 ml。之后按1.3.2蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法操作，測(cè)定其在500 nm處的吸光度，并按下式計(jì)算總黃酮得率。

1.3.5 總黃酮提取的單因素和正交試驗(yàn) 試驗(yàn)提取次數(shù)選取為1次、2次、3次和4次四個(gè)水平;乙醇濃度為40%、50%、60%、70%、80%和90%六個(gè)水平;料液比選取 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 和 1∶30 五個(gè)水平，提取溫度選取40℃、50℃、60℃、70℃和80℃五個(gè)水平;提取時(shí)間選取 0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h和3 h六個(gè)水平;分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取適宜的浸提次數(shù)后，采用適宜的乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.3.6 地木耳總黃酮的抑菌試驗(yàn) 將各種待試菌用適宜斜面活化后，以無菌生理鹽水配制成107CFU/ml的菌懸液，備用。量取由驗(yàn)證試驗(yàn)得到的總黃酮提取液10 ml作為原液，采用二倍稀釋法，用無菌水配制成不同濃度的溶液，依次為100%、50%、25%、12.5%、6.25%，并以無菌水作為對(duì)照，即濃度為0%;經(jīng)微孔過濾器過濾除菌后，于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用濾紙片法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，其具體方法是:將已冷卻至45℃的高壓滅菌后的培養(yǎng)基倒平板，待培養(yǎng)基凝固后，用無菌吸管吸取菌懸液0.2 ml涂平板。用無菌鑷子將滅菌后的濾紙片(直徑為6 mm)放入地木耳總黃酮溶液中，浸泡0.5 h后取出，將含樣品的紙片貼于平板上，每個(gè)紙片相隔一定間距，每種菌各設(shè)3個(gè)重復(fù)，結(jié)果取平均值。將貼好濾紙片的平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)菌于37℃培養(yǎng)24 h，白假絲酵母菌和霉菌于28℃分別培養(yǎng)48 h。使用游標(biāo)卡尺精確測(cè)定濾紙片的抑菌圈直徑大小，比較抑其菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取次數(shù)對(duì)地木耳總黃酮得率的影響 圖1為乙醇濃度為60%，料液比為1∶15，提取溫度為60℃，提取時(shí)間為1.5 h的條件下，提取次數(shù)對(duì)地木耳總黃酮得率的影響。由圖可知，隨著提取次數(shù)的增加，總黃酮得率逐漸增加，當(dāng)提取次數(shù)大于2次時(shí)，總黃酮提取得率增加幅度明顯減小。因此，從生產(chǎn)成本及效率方面考慮，選擇浸提次數(shù)為2次較為合適。

圖1 浸提次數(shù)對(duì)地木耳總黃酮得率的影響Fig1 The effect of extraction frequencies on the yield of total flavonoids from Nostoc commune

2.2 乙醇濃度對(duì)地木耳總黃酮得率的影響 圖2為提取次數(shù)為2次，料液比為1∶15，溫度為60℃時(shí)，提取時(shí)間為1.5 h，不同乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響?？梢钥闯?，隨著乙醇體積的增多，黃酮得率逐漸增加，當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí)，其得率為最大值;濃度超過80%時(shí)，黃酮得率反而下降，其可能原因是提取溶劑中乙醇含量增大，從而造成脂溶性雜質(zhì)增多的緣故［9］。另外，當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)，黃酮得率為6.09%，與最大值6.14%相差無幾。因此，從生產(chǎn)工藝對(duì)試劑損耗方面考慮，選擇乙醇濃度為70%較為經(jīng)濟(jì)。

圖2 乙醇濃度對(duì)地木耳總黃酮含量的影響Fig2 The effect of ethanol concentration on harvesting total flavonoids from Nostoc commune

2.3 料液比對(duì)地木耳總黃酮得率的影響 圖3為提取次數(shù)為2次，乙醇濃度為70%，提取溫度為60℃時(shí)，提取時(shí)間為1.5 h，不同料液比對(duì)地木耳總黃酮得率的影響。結(jié)果表明，隨著料液比的增加，總黃酮的得率顯著增加;當(dāng)料液比大于1∶20時(shí)，其得率反而有下降的趨勢(shì)?？赡茉蚴请S著溶劑的增加，總黃酮的溶解量也增加，當(dāng)總黃酮已全部溶解，即使再增加溶劑的量，也不會(huì)使溶劑中的總黃酮的量增加，反而會(huì)稀釋了總黃酮的溶質(zhì)濃度，從而不利于總黃酮的沉淀。另外，考慮到料液比較大時(shí)，干燥、濃縮的工作量及能耗都相應(yīng)增大，不符合實(shí)際生產(chǎn)的成本要求，因此，料液比不宜過高。

圖3 料液比對(duì)地木耳總黃酮得率的影響Fig3 The effect of material/solvent ratio on output of total flavonoids from Nostoc commune

2.4 溫度對(duì)地木耳總黃酮得率的影響 圖4為提取次數(shù)為2次，乙醇濃度為70%，料液比為1∶20，時(shí)間為1.5 h時(shí)，不同提取溫度對(duì)地木耳總黃酮得率的影響。從中可以看出，當(dāng)提取溫度從40℃增加到70℃時(shí)，地木耳總黃酮的得率增加較為明顯，當(dāng)溫度大于70℃時(shí)，其得率增加幅度明顯減小?？赡茉蚴菧囟冗^高會(huì)對(duì)黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)造成破壞，同時(shí)加速了乙醇的揮發(fā)，從而影響到總黃酮的得率。因此，黃酮的提取溫度不宜過高。

圖4 提取溫度對(duì)地木耳總黃酮得率的影響Fig4 The effect of extraction temperature on Nostoc commune flavonoids products

2.5 時(shí)間對(duì)地木耳總黃酮得率的影響 總黃酮浸出與時(shí)間的關(guān)系較為密切，時(shí)間過短，總黃酮不能完全浸出，時(shí)間過長(zhǎng)，更多的雜質(zhì)被溶解，從而影響其得率［10］。圖 5為提取次數(shù)為 2次，乙醇濃度為70%，料液比為1∶20，提取溫度為70℃時(shí)，不同提取時(shí)間對(duì)地木耳總黃酮得率的影響。結(jié)果表明，當(dāng)提取時(shí)間小于2 h時(shí)，地木耳總黃酮得率增加顯著;當(dāng)提取時(shí)間大于2 h時(shí)，其總黃酮得率增加緩慢，幾乎維持在同一水平。考慮到浸提時(shí)間延長(zhǎng)能耗增加等因素，選取浸提時(shí)間為2 h。

圖5 提取時(shí)間對(duì)地木耳總黃酮得率的影響Fig5 The effect of extraction duration on the output of total flavonoids form Nostoc commune

2.6 正交法提取地木耳總黃酮 為了考慮到各因素之間的相互作用，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)。以提取次數(shù)為2次，采用L16(45)正交表，對(duì)乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間和進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果如表1所示，其方差分析如表2所示。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Tab1 Orthogonal test results and analysis

由表1正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果可知，各因素對(duì)總黃酮得率影響大小的順序?yàn)?乙醇濃度＞料液比＞提取溫度＞提取時(shí)間。通過表2正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果可知，乙醇濃度、液料比和提取溫度對(duì)地木耳總黃酮得率的影響達(dá)到了極顯著水平，提取時(shí)間對(duì)地木耳總黃酮得率的影響差異不顯著，但黃酮得率也有一定的影響。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Tab2 Analysis of variances for total flavonoids yield

由表1極差分析T值可知，當(dāng)提取次數(shù)為2次時(shí)，地木耳總黃酮提取的最優(yōu)水平組合為乙醇濃度70%、料液比為1∶20、提取溫度80℃，提取時(shí)間為2.5 h。在此條件下，進(jìn)行地木耳總黃酮提取驗(yàn)證試驗(yàn)，3次重復(fù)，其總黃酮平均得率為6.84 mg/g。

2.7 地木耳總黃酮對(duì)常見微生物的抑菌活性 由驗(yàn)證試驗(yàn)所得黃酮得率為6.84 mg/g，地木耳黃酮提取液濃度為 100%、50%、25%、12.5%、6.25和0%所對(duì)應(yīng)的實(shí)際黃酮含量分別為0.342 mg/ml、0.171 mg/ml、0.0855 mg/ml、0.04275 mg/ml、0.02138 mg/ml和 0 mg/ml。選取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉和白假絲酵母菌四種日常生活中常見的細(xì)菌、霉菌和酵母菌作為試驗(yàn)材料，測(cè)試所提取的總黃酮對(duì)這些菌種的抑菌效果，其結(jié)果見圖6。

圖6 地木耳總黃酮的抑菌作用Fig6 The antimicrobial activities of Nostoc commune flavonoids on certain microorganisms

圖6結(jié)果表明，地木耳總黃酮對(duì)四種微生物均有不同程度的抑制作用，隨著總黃酮溶液質(zhì)量濃度的升高，抑菌圈直徑有遞增趨勢(shì)性。其中，地木耳總黃酮對(duì)典型的革蘭陽性細(xì)菌金黃色葡萄球菌抑制作用最強(qiáng)，對(duì)革蘭陰性細(xì)菌抑制作用相對(duì)較弱;對(duì)酵母菌抑菌活性相對(duì)較強(qiáng)，而對(duì)產(chǎn)孢子的霉菌抑制能力較弱?？梢姡啬径S酮具有一定的廣譜抑菌活性。

3 討論

黃酮類化合物是廣泛存在于植物體內(nèi)，能夠清除人體內(nèi)自由基，具有抗老化、抗突變、調(diào)血脂、降血壓、抑菌等藥理保健功能，是一類極具開發(fā)前景的天然有機(jī)抗氧化劑［11－12］。本研究通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得出了地木耳總黃酮提取的最佳條件，即提取溫度為乙醇濃度70%、料液比為1∶20、提取溫度80℃，提取時(shí)間為2.5 h，提取次數(shù)為2次，在此最佳條件下總黃酮得率為6.84 mg/g，這為地木耳黃酮的應(yīng)用提供了的前提條件。

另外，試驗(yàn)結(jié)果表明，地木耳總黃酮對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉和白假絲酵母均有一定的抑制作用，其抑菌效果為金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞白假絲酵母＞黑曲霉。黃酮類化合物可以通過破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致微生物細(xì)胞釋放胞內(nèi)成分，引起膜的電子傳遞、營(yíng)養(yǎng)吸收、核苷酸合成及ATP活性等功能障礙，從而抑制微生物的生長(zhǎng)［13］。由于真菌的細(xì)胞壁厚于細(xì)菌的細(xì)胞壁，導(dǎo)致黃酮類化合物對(duì)兩種類型菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜損傷程度不同所造成的。從而造成地木耳總黃酮對(duì)細(xì)菌抑制作用大于真菌。革蘭陽性菌與革蘭陰性菌的細(xì)胞壁組成成分不同，革蘭陽性菌肽聚糖層多，革蘭陰性菌肽聚糖層數(shù)少，黃酮類化合物有可能影響肽聚糖的交聯(lián)，進(jìn)而破壞細(xì)胞壁形成。也有研究表明［14］，抑菌性的差異可能與樣品作用于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜系統(tǒng)，或者對(duì)酶的抑制、代謝過程的破壞有著密切關(guān)系，但具體原因還有待于進(jìn)一步研究。本文通過地木耳總黃酮的抑菌試驗(yàn)，初步得出了一定的結(jié)論，但由于試驗(yàn)選用菌種有限，其試驗(yàn)結(jié)果還不夠全面，在今后的研究中將利用地木耳總黃酮對(duì)大量的微生物進(jìn)行系統(tǒng)的抑菌試驗(yàn)，并深入探討其抑菌效果和機(jī)制，為新型天然抗菌劑的開發(fā)提供依據(jù)。

［1］張?zhí)苽?，楊樂，柳青海，王啟蘭，等.地木耳多糖的抗氧化性與抑菌作用［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，30(6):868－873.

［2］牛生洋，郝峰鴿，趙瑞香，等.地皮菜中多糖的抑菌特性研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，(9):93－94.

［3］JAKI B，ORJALA J，HEILMANN J.New antibacterial metabolites from the CyanobacteriumNostoc commune［J］.Journal of Natural Products，2000，63(9):1283－12850.

［4］鄢貴龍，紀(jì)麗蓮，韓銘海，等.地皮菜營(yíng)養(yǎng)成分分析與評(píng)價(jià)［J］.營(yíng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，32(1):97－98.

［5］PLOUTNO A，CARMELI S.Modified peptides from a water bloom of the cyanobacterium Nostoc sp［J］.Tetrahedron，2002，58(50):9949－9957.

［6］GOLAKOTI T，YOSHIDA W Y，CHAGANTY S，MOORE R E.Isolation and structure determination of nostocyclopeptides A1 and A2 from the cyanobacterium Nostoc sp.ATCC53789 ［J］.JNat Prod，2001，64(1):54－59.

［7］張威.地木耳天然活性物質(zhì)的篩選及活性研究［D］.蘭州:蘭州大學(xué)，2007.

［8］孔琪，吳春.菊花黃酮的提取及抗氧化活性研究［J］.中草藥，2004，35(9):1001－1002.

［9］楊瑞云，管海波，張革，等.當(dāng)歸藤中總黃酮提取工藝研究［J］.食品工業(yè)科技，2011，32(4):217－219.

［10］郭嬌嬌，羅佳，宮智勇.桂花中總黃酮提取工藝及其抗氧化活性的研究［J］.武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，3(1):5－7.

［11］KANWAL Q，HUSSAIN I，SIDDIQUIH L，et al.Flavonoids from mango leaves with antibacterial activity［J］.J Serb Chem Soc，2009，74(12):1389－1399.

［12］常麗新，賈長(zhǎng)紅，高曼，等.丁香葉黃酮的抑菌作用［J］.食品工業(yè)科技，2010，31(10):126－128.

［13］玄紅專，胡福良.黃酮類化合物抑制微生物活性及其作用機(jī)制［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2010，22(1):171－175.

［14］史德芳.仙人掌提取物的分離及其抑菌性能的研究［D］.廣西:廣西大學(xué)，2006.