基因芯片方法快速檢測MDR-TB及利福平和異煙肼耐藥基因的研究

張海英，高會霞，許 怡

（1.河北省石家莊市第五醫(yī)院皮膚科，河北石家莊050021；2.河北省石家莊市第五醫(yī)院檢驗科，河北石家莊050021）

基因芯片方法快速檢測MDR-TB及利福平和異煙肼耐藥基因的研究

張海英1，高會霞2，許 怡2

（1.河北省石家莊市第五醫(yī)院皮膚科，河北石家莊050021；2.河北省石家莊市第五醫(yī)院檢驗科，河北石家莊050021）

目的使用基因芯片結(jié)合儀器法液體快速培養(yǎng)分析耐多藥（multidrug resistant，MDR）結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）的耐藥基因和表型特征。方法應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增-基因芯片雜交法檢測耐多藥結(jié)核分枝桿菌（multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB）菌株中利福平（rifampin，RFP）和異煙肼（isoniazid，INH）耐藥基因的突變位點及類型，平行用BD MGIT960系統(tǒng)檢測所選菌株對RFP和INH的敏感性。結(jié)果以MGIT960藥敏結(jié)果作為參考標(biāo)準(zhǔn)，34株MDR-TB中，基因芯片檢測MTB對RFP、INH藥的符合率分別為85.29%和94.11%；32株RFP耐藥突變株中22株為rpoB基因531位密碼子突變，29株INH耐藥突變株中24株為katG基因315位密碼子突變。結(jié)論基因芯片技術(shù)可快速、有效地檢出MDR-TB，可以在未獲得傳統(tǒng)細(xì)菌表型藥敏結(jié)果前指導(dǎo)臨床用藥治療。

分枝桿菌，結(jié)核；利福平；異煙肼；寡核苷酸序列分析

中國每年發(fā)生耐多藥（multidrug resistant， MDR）結(jié)核病患者為全球最高，約占全球病例的1/4。結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）是慢生長分枝桿菌，常規(guī)的藥敏試驗需3～4周的時間，液體快速培養(yǎng)法也需要8～14d，因此結(jié)核患者通常不能得到及時有效的治療，導(dǎo)致耐多藥結(jié)核患者結(jié)核菌的增殖和傳播。因此，創(chuàng)建快速、簡便、準(zhǔn)確的檢測方法是實現(xiàn)對結(jié)核病及時有效治療的前提條件。基因芯片是近年發(fā)展起來的一種新方法。這種方法是利用MTB耐藥性與基因突變有關(guān)的分子機制，對其與耐藥性相關(guān)的突變位點進(jìn)行檢測，根據(jù)檢測位點的突變情況判斷MTB的耐藥性，將耐藥性檢測的時間縮短到3～4h。達(dá)到快速、靈敏、準(zhǔn)確檢測耐藥性的目的。本研究用基因芯片技術(shù)檢測MDR情況，并與液體快速培養(yǎng)法藥敏結(jié)果進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 菌株來源：34株MDR臨床分離株由本院保存，已按全國結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)程進(jìn)行菌種鑒定證實為Mtb，并用BD MGIT960系統(tǒng)檢測所選菌株對利福平（rifampin，RFP）和異煙肼（isoniazid，INH）藥均耐藥。同時選取10株對RFP和INH敏感株作為對照。

1.2 試劑和儀器：美國BD公司生產(chǎn)的BACTEC MGIT 960 system及其配套試劑，包括MGIT 7mL培養(yǎng)管、含有生長因子的抗生素添加劑、藥敏所需添加的抗生素。Mtb耐藥檢測試劑盒（芯片法）、擴增儀和微陣列芯片掃描儀等均為博奧生物有限公司提供。

1.3 基因芯片技術(shù)檢測

1.3.1 樣品制備：采用Extractor 36核酸快速提取儀提取核酸，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR擴增：每管PCR反應(yīng)體系總體積為20μL，第1管為Mtb分離株DNA模板20μL和180μL PCR擴增劑1，產(chǎn)物為對照產(chǎn)物，與2種微陣列都進(jìn)行雜交；第2管為Mtb分離株DNA模板20μL和180μL PCR增劑2，為rpoB基因的擴增產(chǎn)物，與RFP微陣列相對應(yīng)；第3管為Mtb分離株DNA模板20μL和180μL PCR擴增劑3，為katG基因及inhA的擴增產(chǎn)物，與INH微陣列相對應(yīng)；將反應(yīng)體系放置基因擴增儀上進(jìn)行擴增，并將擴增產(chǎn)物4℃保存。

1.3.3 芯片雜交及洗干：每管雜交反應(yīng)混合物總體積為15μL，雜交反應(yīng)混合物R為PCR擴增產(chǎn)物1和PCR擴增產(chǎn)物2各3μL及雜交緩沖液9μL，雜交反應(yīng)混合物H為PCR擴增產(chǎn)物1和PCR擴增產(chǎn)物3各3μL及雜交緩沖液9μL，將雜交反應(yīng)混合物加熱至95℃變性5min，再冰浴3min。將雜交反應(yīng)混合物R加入到HybSet基因微陣列芯片點陣1或3中，雜交反應(yīng)混合物H加入到HybSet基因微陣列芯片點陣2或4中；然后放入晶芯Biomixer芯片雜交儀進(jìn)行芯片反應(yīng)。再將完成雜交的芯片放入晶芯SlideWasher TM芯片洗干儀中進(jìn)行洗干。對于RFP耐藥相關(guān)基因rpoB基因檢測6個位點，包括531位TCG→TTG、531位TCG→TGG、526位CAC→GAC、526位CAC→TAC、526位CAC→CTC、526位CAC→CGC、511位CTG→CCG、513位CAA→CCA、513位CAA→AAA、516位GAC→GTC、516位GAC→TAC、516位GAC→GGC及533位CTG→CCG等13種突變型，對于INH耐藥相關(guān)基因katG基因及inhA基因啟動子各檢測1個位點，分別為katG基因315位AGC→ACC和AGC→AAC 2個突變型，inhA基因啟動子-15位C→T突變型。

1.3.4 結(jié)果判讀：將洗干的芯片載入晶芯LuxScan 10KB微陣列芯片掃描儀中，自動進(jìn)行結(jié)果判讀。

2 結(jié) 果

2.1 基因芯片技術(shù)檢測MDR-TB對RFP、INH耐藥的評價結(jié)果：基因芯片技術(shù)對RFP、INH耐藥情況的檢測效果與金標(biāo)準(zhǔn)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）?；蛐酒夹g(shù)檢測RFP的靈敏度和特異度分別為94.11%和100.00%，Kappa值為0.88，陽性預(yù)測值（positive predictive value，PPV）和陰性預(yù)測值（negative predictive value，NPV）分別為100.00%和83.30%?；蛐酒夹g(shù)檢測異煙肼的靈敏度和特異度分別為85.29%和90.00%，Kappa值為0.88，陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為96.67%和64.28%。見表1，2。

表1 基因芯片技術(shù)檢測RFP耐藥情況的評價結(jié)果Table 1 The evaluation of the gene chip detection of rifampicin drug resistance

表2 基因芯片技術(shù)檢測INH耐藥情況的評價結(jié)果Table 2 The evaluation of the gene chip detection of isoniazid drug resistance

2.1 MDR-TB的rpoB、katG和inhA基因突變譜的分布情況：32株RFP耐藥突變株中22株（68.75%）為rpoB基因531位突變，其中21株為TCG→TTG突變，1株為TCG→TGG突變；4株（12.50%）為526位突變，其中3株為CAC→GAC突變，1株為CAC→GGC突變；3株（9.37%）為516位突變，其中2株GAC→GTC突變，1株GAC→TAC突變；1株（3.12%）為511位突變，為CTC→CCG突變；1株（3.12%）為513位突變，為CAA→AAA突變；1株（3.12%）為雙位點突變。29株IMH耐藥突變株中24株（82.76%）為katG基因突變，其中23株為315位AGC→ACC突變，1株為AGC→AAC突變；4株（13.79%）為inhA突變的分離株均為-15位C→T突變；其中1株既有katG基因突變又有inhA突變。部分基因芯片結(jié)果見圖1，2。

圖1 MDR-TB利福平rpoB基因部分芯片雜交圖A.516（A→T），526（C→T），531（C→T）突變型；B.513（C→A），526（A→G）突變型Figure 1 The result of rpoB gene in MDR-TB by gene chipA.516（A→T），526（C→T），531（C→T）mutant type；B.513（C→A），526（A→G）mutant type

圖2 MDR-TB異煙肼katG基因部分芯片雜交圖A.315（G→A）突變型inhA野生型；B.315（G→C）突變型inhA野生型Figure 2 The result of katG gene in MDR-TB by gene chipA.315（G→A）mutant type inhA wild type；B.315（G→C）mutant type inhA wild type

3 討 論

MDR-TB是指結(jié)核病患者排出的結(jié)核分枝桿菌對至少包括INH和RFP在內(nèi)的2種或以上藥物產(chǎn)生耐藥。MDR-TB比MTB敏感株引起的結(jié)核病更加難治，且病死率更高。中國的耐藥性結(jié)核病情況嚴(yán)重，中國耐藥結(jié)核患者數(shù)占世界病例總數(shù)的24%，在新增病例中MDR結(jié)核病流行比例達(dá)到了5.7%，是世界平均水平的近2倍［1］。

96%～98%的RFP耐藥菌都是由于編碼RNA聚合酶b亞基（rpoB）基因（RNA polymerase subunit gene）的507～533位密碼子的81bp高變區(qū)域發(fā)生突變，從而不再與RFP結(jié)合而產(chǎn)生耐藥性［2］。如此高的突變率發(fā)生在此區(qū)域內(nèi)，而單耐RFP菌株又極罕見，使rpoB基因突變成為檢測MDR-TB的重要標(biāo)志。INH耐藥株主要與katG基因和inhA啟動子突變有關(guān)，katG基因主要是315位密碼子AGC→ACC的突變，該突變引起過氧化氫酶活性降低導(dǎo)致INH耐藥［3］。因此，這些區(qū)域是RFP和INH耐藥株分子檢測的主要靶位［4-5］，應(yīng)用基因芯片技術(shù)快速檢出katG、inhA和rpoB基因的突變進(jìn)行INH和RFP的耐藥性檢測，可以作為耐多藥結(jié)核病的診斷指標(biāo)。但同時耐藥基因突變特點也因國家和地區(qū)而有所差異。因此，耐多藥結(jié)核病快速診斷試劑盒在不同地區(qū)對RFP和INH耐藥敏感度差異有統(tǒng)計學(xué)意義。有研究［6-7］顯示，與DNA測序相比，基因芯片技術(shù)檢測INH耐藥的靈敏度和特異度均為100.00%；與傳統(tǒng)藥敏試驗相比，檢測RFP耐藥的靈敏度和特異度分別為76.3%和80.0%。本研究結(jié)果顯示檢測RFP的靈敏度和特異度分別為94.11%和100.00%，檢測INH的靈敏度和特異度分別為85.29%和90.00%，與我國的研究結(jié)果接近［8］。而且，本研究發(fā)現(xiàn)，與金標(biāo)準(zhǔn)相比，檢測RFP耐藥的PPV和NPV分別為100.00%和83.30%，檢測INH耐藥的PPV和NPV分別為96.67%和64.28%，檢測RFP和INH耐藥的Kappa值均為0.88，根據(jù)Kappa值判定標(biāo)準(zhǔn)，0.41～0.80為中高度，0.81～1.00為最強度，說明基因芯片技術(shù)檢測RFP耐藥和INH耐藥的一致性為最強度。Guo等［9］研究發(fā)現(xiàn)，以痰標(biāo)本為檢測對象，與傳統(tǒng)藥敏試驗相比，基因芯片技術(shù)檢測INH和RFP耐藥的一致率分別為787.1%和94.6%，與本研究結(jié)果相似。因此，以靈敏度、Kappa值和PPV為評價指標(biāo)進(jìn)行綜合評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因芯片技術(shù)對MDR的檢測效果理想，在實際應(yīng)用中基因芯片技術(shù)對MDR檢測結(jié)果均具有較高的可靠性和真實性。

本研究所用基因芯片可檢出MDR-TB常見的基因突變位點，包括MTB耐藥特定基因rpoB的8l bp核心區(qū)域、katG315密碼子和inhA啟動子基因突變。rpoB基因中最常見的突變位點是531位、526位和516位，并且531＞526＞516［10-11］，本研究中檢測到的最常見的突變位點也是531位、526位和516位，與報道一致。此外，6株在分析的部位未發(fā)現(xiàn)基因突變，有可能在本檢測范圍外的其他位點存在突變，或者是存在其他耐藥機制，或者傳統(tǒng)藥敏試驗誤差所致。而耐INH主要與315位的密碼子AGC→ACC的突變有關(guān)［12］。在本研究中29株INH耐藥突變株中，24株（82.76%）為katG基因突變，其中23株為315位AGC→ACC突變，與張俊仙等［12］的報道一致。inhA基因編碼脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白（NADH依賴的enoyl-ACP還原酶）是分枝菌酸細(xì)胞壁合成的必需成分，活化的INH結(jié)合到NADH上抑制了依賴NADH酶的活性，抑制了分枝菌酸的合成而導(dǎo)致了細(xì)胞的死亡，inhA基因的突變修改了該酶，使它失去了與NADH的親和力，導(dǎo)致INH耐藥［13］。在本研究中4株（13.79%）INH耐藥突變株與inhA基因-15位C→T突變，與報道一致［14］。

綜述所述，耐多藥結(jié)核病快速診斷試劑盒可以檢測到絕大多數(shù)耐RFP和INH菌株，從而有效指導(dǎo)臨床用藥，且該方法以基因型為基礎(chǔ)，重復(fù)性好，操作簡便，結(jié)果判斷比較容易。

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（本文編輯：趙麗潔）

RAPID DETECTION OF DRUG RESISTANT RELATED GENES IN MULTIDRUGRESISTANT TUBERCULOSIS BY GENE CHIP AND RIFAMPIN AND ISONIAZID RESISTANCE GENE

ZHANG Haiying1，GAO Huixia1，XV Yi2
（1.Department of Dermatology，the Fifth Hospital of Shijiazhuang City，Hebei Province，Shijiazhuang 050021，China；2.Department of Laboratory，the Fifth Hospital of Shijiazhuang City，Hebei Province，Shijiazhuang 050021，China）

ObjectiveTo analyze the characteristics of phenotype and genotype of multidrug resistant tuberculosis（MDR-TB）by gene chip and liquid culture.MethodsGene chip MDR-TB kits were used for identifying the types of rifampin（RFP）and isoniazid（INH）antituberculosis drug resistant genes partly and BD MGIT960 was used for detecting the drug susceptibility.ResultsCompared with MGIT960，the coincidence rate of gene chip MTBDR plus was 85.29%and 94.11%in RFP-resistant strain and INH resistant strain in 34 MDR-TB strains；Among 32 RFP-resistant mutation strains，S531L of rpoB gene accounted for 22 strains.MTB resistant to INH was caused by the mutation of katG chiefly and the S315T1 accounted for 24 strains in 29 INH-resistant strains.ConclusionGene chip might be a rapid and effective method for the detection of MDR-TB.So，it could be used as an assistant method to guide the therapy on clinic.

mycobacterium tuberculosis；rifampin；isoniazid；oligonucleotide array sequence analysis

2012-05-16；

2012-09-27

石家莊市科技局攻關(guān)項目（11146643）

張海英（1973-），女，河北南宮人，河北省石家莊市第五醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事皮膚科疾病診治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.12.021

R378.911

A

1007-3205（2012）12-1421-04