胰腺癌中ARHI蛋白表達及臨床意義

路新卿，張再興，沈香榮，李桂英，呂英剛，劉志軍*

（1.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河北邯鄲056000；2.河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，河北唐山063000）

胰腺癌中ARHI蛋白表達及臨床意義

路新卿1，張再興2，沈香榮1，李桂英1，呂英剛1，劉志軍1*

（1.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河北邯鄲056000；2.河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，河北唐山063000）

目的探討ARHI（aplysia ras homolog I）蛋白在胰腺癌組織中的表達及臨床意義。方法采用免疫組織化學(xué)方法檢測62例胰腺癌組織及30例胰腺癌旁黏膜組織中ARHI蛋白的表達，分析ARHI蛋白表達與臨床病理因素兩者之間的關(guān)系。結(jié)果胰腺癌組織中ARHI蛋白表達明顯低于癌旁組織（P＜0.01）；臨床Ⅰ～Ⅱ期胰腺癌組織中ARHI蛋白表達水平高于Ⅲ～Ⅳ期（P＜0.05）；高、中分化胰腺癌組織中ARHI蛋白表達高于低分化胰腺癌（P＜0.05）；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胰腺癌患者ARHI蛋白表達水平低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P＜0.05）。結(jié)論ARHI蛋白在胰腺癌組織中表達降低，ARHI蛋白可能在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

胰腺腫瘤；蛋白；免疫組織化學(xué)

胰腺癌惡性程度高，預(yù)后差，其發(fā)病率近幾年有上升的趨勢，其發(fā)病機制目前還不十分清楚。ARHI（aplysia ras homolog I）基因是一個母源性印跡腫瘤抑制基因［1］，結(jié)構(gòu)上與Ras家族具有高度同源性，屬于小分子G蛋白的一種。研究［2-3］證實，盡管ARHI屬于Ras超家族成員之一，但與大部分Ras家族成員都是癌基因不同，ARHI具有抑癌作用。我們的研究證實ARHI基因是胰腺癌相關(guān)的抑癌基因，ARHI可明顯地誘導(dǎo)胰腺癌細胞發(fā)生凋亡［4］，這可能在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中起了重要的作用。本研究采用免疫組織化學(xué)方法分析ARHI蛋白在胰腺癌中的表達情況，探討ARHI與胰腺癌臨床病理學(xué)之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇1996年11月—2011年10月本院手術(shù)的胰腺癌患者62例，男性37例，女性25例，年齡28～76歲，平均61.28歲。所有患者術(shù)前都沒有放療及化療。手術(shù)切下標(biāo)本后10min內(nèi)取材，取材時避免取到明顯的壞死區(qū)域，同時在上述62例胰腺癌中分別取癌旁組織30例，且離腫瘤至少1.5cm處切取對應(yīng)的遠端正常胰腺組織。

1.2 實驗方法：胰腺癌組織進行免疫組織化學(xué)分析。ARHI蛋白的免疫組織化學(xué)采用SP法，SP試劑盒購自北京中山公司。胰腺癌組織石蠟切片60℃干烤4h后，常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫浸泡10min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，然后加入10mmol/L pH6.0枸櫞酸鈉緩沖液100℃煮沸10min，進行抗原修復(fù)。室溫自然冷卻30min后加入正常馬血清室溫下封閉20min，加入一抗小鼠抗人ARHI單克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology）按1∶100稀釋，4℃過夜，PBS洗3次后加入生物素化二抗室溫30min，PBS洗3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶親和素室溫下30min，PBS洗3次，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片后光鏡下觀察。

1.3 結(jié)果判定：以已知陽性組織切片做陽性對照，以PBS代替一抗做陰性對照。根據(jù)陽性區(qū)域染色強度評分（0分，無著色；1分，淡黃色；2分，黃色；3分，棕黃色）及陽性細胞所占比例評分（0分，1%；1分，＞1%～10%；2分，＞10%～50%；3分，＞50%～75%；4分，＞75%～100%）進行半定量免疫組織化學(xué)評分［5-6］。計算2項評分的乘積，分值的范圍在0～12分，超過3分則認為ARHI蛋白表達陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Logstic回歸分析相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胰腺癌中ARHI蛋白表達：在正常胰腺組織中，ARHI表達的陽性率為83.33%（25/30）。大多數(shù)腺泡細胞和導(dǎo)管細胞未見有ARHI蛋白的表達，少數(shù)散在的腺泡細胞的胞漿中可見ARHI的表達，這些細胞主要位于腺泡腔的的外面。在胰腺癌中ARHI的表達明顯降低48.39%（30/62），兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖1，表1。

圖1 ARHI在正常胰腺（A）和胰腺癌（B）組織中的表達（SP×400）A.正常胰腺；B.胰腺癌Figure 1 The expression of ARHI protein in pancreatic cancer and normal pancreatic tissues（SP×400）A.Normal pancreatic tissue；B.Pancreatic cancer tissue

表1 ARHI在正常胰腺組織及胰腺癌組織中的表達Table 1 The expression of ARHI protein in pancreatic cancer and normal pancreatic tissues

2.2 ARHI蛋白表達與胰腺癌臨床病理因素關(guān)系：ARHI蛋白表達與胰腺癌原發(fā)部位及腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05），而與TNM分期、腫瘤的分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05）。TNM分期Ⅰ～Ⅱ期胰腺癌ARHI蛋白表達率（84.62%）高于Ⅲ～Ⅳ期（27.78%）（P＜0.05）；高中分化胰腺癌組織中ARHI蛋白的表達量（80.56%）高于低分化者（38.46%）（P＜0.05）；胰腺癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移ARHI蛋白的表達量（35.29%）低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（68.89.%）（P＜0.05）。見表2。

2.3 ARHI蛋白表達與胰腺癌預(yù)后相關(guān)性分析：將影響生存的指標(biāo)包括性別、年齡、病理類型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和治療方式等分別進行統(tǒng)計分析，分析結(jié)果表明ARHI蛋白表達、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的重要因素（P＜0.05），見表3。

表2 胰腺癌臨床病理因素與ARHI蛋白表達的關(guān)系Table 2 The relationships between the expression of ARHI and pathological indexes

表3 胰腺癌預(yù)后相關(guān)因素的Logostic回歸分析Table 3 Logostic regression analysis of prognostic faetors in pancreatic cancer

3 討 論

研究［7］表明，許多抑癌基因的表達降低或失活在胰腺癌的發(fā)生中發(fā)揮了重要的作用。1999年Yu等［1］用差異PCR的方法，從人卵巢和乳腺上皮細胞及其癌細胞中克隆了一種新的候選抑癌基因，命名為ARHI（NOEY2）基因，該基因是成人癌中第一個被描述的候選印跡抑癌基因。ARHI基因在正常乳腺及卵巢上皮中均有表達，而在乳腺癌及卵巢癌細胞中表達缺失。有學(xué)者［8］證實，ARHI基因是一種印跡抑癌基因，在漿液性卵巢癌細胞中表達下調(diào)。唐海靈等［9］發(fā)現(xiàn)，ARHI蛋白在胃癌組織中表達明顯下調(diào)或缺失，而在胃正常組織中普遍表達，ARHI蛋白表達與患者腫瘤的分化程度及TNM分期有關(guān)。本研究證實，將ARHI基因?qū)肴狈υ摶虮磉_的腫瘤細胞中，可以抑制腫瘤細胞的增殖和遷移，促進細胞凋亡，因此，本課題從臨床組織病理學(xué)的角度，研究了ARHI基因與胰腺癌的關(guān)系，為臨床正確評估胰腺癌的預(yù)后提供方法。

本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)對胰腺癌組織中ARHI蛋白的表達進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中ARHI蛋白陽性表達率明顯低于正常胰腺黏膜組織。盧朝輝等［10］觀察到，除胰腺導(dǎo)管、胰腺上皮及一些癌細胞可見陽性染色外，大部分纖維組織、平滑肌、血管壁以及腸黏膜上等均可見陽性著色。提示在正常情況下，ARHI是一種在多組織中均有表達的基因。ARHI在胰腺癌組織中呈下調(diào)表達，可能是一個抑癌基因。體外實驗［3］表明，ARHI可明顯的誘導(dǎo)胰腺癌細胞發(fā)生凋亡，死亡相關(guān)蛋白激酶1參與了ARHI引起凋亡的機制。ARHI表達下調(diào)可能在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中起了重要的作用。本研究結(jié)果顯示，ARHI蛋白異常表達在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。另外，我們還評價了ARHI與胰腺癌臨床病理學(xué)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)ARHI的低表達與胰腺癌的不良分化程度明顯相關(guān)，這說明ARHI也可能參與組織上的分化。同時ARHI蛋白在不同腫瘤大小及原發(fā)部位胰腺癌患中的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但ARHI表達與TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，說明胰腺癌中ARHI蛋白表達與病變的進展及侵襲性有關(guān)。有研究［3］表明，印跡抑癌基因ARHI誘導(dǎo)細胞凋亡及DNA甲基化在胰腺癌發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。此外，Lu等［2］發(fā)現(xiàn)ARHI基因通過誘導(dǎo)G1期細胞組織而抑制胰腺癌細胞生長。由于ARHI基因突變或失活，導(dǎo)致ARHI蛋白低水平表達或表達缺失，從而失去了對細胞生長、增殖的負性調(diào)節(jié)作用，促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。證實ARHI蛋白可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

ARHI的低表達是胰腺癌中的一個重要事件，與胰腺癌的發(fā)生、分化和發(fā)展有明顯的關(guān)系，因而在胰腺癌的診斷、治療和預(yù)后中可能具有重要的臨床應(yīng)用價值。ARHI在胰腺癌中表達的具體機制及其所起的作用還有待進一步研究。

［1］YU Y，XU F，PENG H，et al.NOEY2（ARHI），an imprintedputative tumor suppressor gene in ovarian and breast carcinomas［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96（1）：214-219.

［2］LU X，QIAN J，YU Y，et al.Expression of the tumor suppressor ARHI inhibits the growth of pancreatic cancer cells by inducing G1 cell cycle arrest［J］.Oncol Rep，2009，22（3）：635-640.

［3］YANG H，LU X，QIAN J，et al.Imprinted tumor suppressor gene ARHI inducesapoptosiscorrelatedwithchangesinDNA methylation in pancreatic cancer cells［J］.Mol Med Report，2010，3（4）：581-587.

［4］路新卿，李桂英，王德峰，等.ARHI基因?qū)σ认侔┘毎蛲龅挠绊懀跩］.臨床薈萃，2011，26（24）2145-2148.

［5］FRIEDRICHS K，GLUBA S，EIDTMANN H，et al.Overexpression of p53 and prognosis in breast cancer［J］.Cancer，1993.72（12）：3641-3647.

［6］王亞飛，祝淑杈，沈文斌.食管癌中MMP-9蛋白表達及其臨床意義［J］.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2008，29（3）：328-332.

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［8］沈文潔，邢福祺，魯永，等.印跡抑癌基因ARHI在漿液性卵巢癌中的表達及甲基化研究［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2008，33（3）：302-304.

［9］唐海靈，胡益群，楊奕軒，等.抑癌基因ARHI在人胃癌組織中的表達及意義［J］.世界華人消化雜志，2011，19（1）：25-30.

［10］盧朝輝，陳杰，谷麗君，等.ARHI在胰腺癌組織中mRNA水平及蛋白表達［J］.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報，2001，23（4）：324-327.

（本文編輯：趙麗潔）

EXPRESSION OF ARHI PROTEIN AND ITS CLINICAL SIGNIFICANCE IN PANCREATIC CANCER

LU Xinqing1，ZHANG Zaixing2，SHEN Xiangrong1，LI Guiying1，LV Yinggang1，LIU Zhijun1*
（1.Department of Gastroenterology，the Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering，Handan 056002，China；2.Department of Otorhinolaryngology，the Afflicated Hospital of Hebei United University，Tangshan 063000，China）

ObjectiveTo investigate the expression of aplysia ras homolog I（ARHI）protein and its clinical significance in pancreatic cancer.MethodsThe expression of ARHI protein were detected in 62 cases of pancreatic cancer samples and 30 cases of normal pancreatic tissues by immunohistochemistry methods.Then the relationship between the expression of ARHI protein in pancreatic cancer and clinical pathological factors was analyzed.ResultsThe expression of ARHI protein in pancreatic cancer tissues was lower than that of normal pancreatic tissues（P＜0.01）.The level of ARHI protein was also lower in pancreatic cancer with lymph node metastasis than that in tissues without metastasis（P＜0.05）.The expression of ARHI protein in clinical stage ofⅠandⅡ，well and moderate differentiation was higher than that ofⅢandⅣstage or lower differentiation（P＜0.05）. Conclusion The expression of ARHI protein is decreased in pancreatic cancer and it maybe play an important role in the tumorigenesis and development.

pancreatic neoplasms；protein；immunohistochemistry

R735.9

A

1007-3205（2012）12-1375-04

2012-08-22；

2012-11-30

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題計劃（20120415）；河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究青年基金項目（2010118）；河北省衛(wèi)生廳科研基金項目（20110156）

路新卿（1975-），男，河北邯鄲人，河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事消化道腫瘤診治研究。

*通訊作者。E-mail：gdyylzj@163.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.12.005