孕中期羊水細(xì)胞培養(yǎng)及其在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

武其文，范含萍，江 峰，浦 春

(皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院 產(chǎn)前診斷中心1.檢驗(yàn)科;2.婦產(chǎn)科;3.超聲醫(yī)學(xué)科，安徽 蕪湖 241001)

染色體疾病是一種常見的遺傳病，無(wú)論是染色體數(shù)目異常還是結(jié)構(gòu)異常均可導(dǎo)致先天畸形、智力低下、流產(chǎn)、不孕、生長(zhǎng)發(fā)育障礙等，是造成新生兒出生缺陷常見的原因［1］。應(yīng)用胎兒脫落羊水細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行染色體核型分析是胎兒染色體病產(chǎn)前診斷的主要方法之一，但羊水細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)要求高、難度大、成功率不穩(wěn)定。如何取得較高的羊水細(xì)胞培養(yǎng)成功率，是這項(xiàng)技術(shù)成功應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵。我院產(chǎn)前診斷中心遺傳室自2009年開展此項(xiàng)技術(shù)，針對(duì)羊水細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了努力的探索和改良，經(jīng)歷了一段時(shí)間后取得了滿意的效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2009年10月～2011年10月期間，因有產(chǎn)前診斷指征在我院接受羊水細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)前診斷的孕婦共238例，年齡22～45歲，孕周16～30周(其中＞22周7例)。孕婦簽署知情同意后實(shí)施羊膜腔穿刺術(shù)。孕婦產(chǎn)前診斷的指征包括:①孕婦年齡≥35歲;②孕婦曾經(jīng)生育過染色體異常患兒史;③母血清生化篩查高風(fēng)險(xiǎn);④超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒異常;⑤夫婦一方有染色體結(jié)構(gòu)異常者;⑥孕婦有原因不明的多次流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)史;⑦羊水過多或過少。

1.2 方法

1.2.1 羊膜腔穿刺采集標(biāo)本 穿刺前囑孕婦側(cè)臥輕輕上下?lián)u動(dòng)腹部數(shù)次，常規(guī)下腹部皮膚消毒、鋪巾，在B超引導(dǎo)下用一次性羊水穿刺針(21 G)經(jīng)腹壁行羊膜腔穿刺術(shù)并抽取羊水。先用5 ml注射器抽取羊水2～3 ml棄去，再用20 ml注射器抽取羊水20 ml，立即送細(xì)胞培養(yǎng)室。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將20 ml羊水分裝于兩只15 ml無(wú)菌離心管(Falcon產(chǎn)品)中，1 000 r/min離心8 min，棄上清，保留每管1 ml，以滴管打勻，分別接種2個(gè)瓶口帶濾膜的50 ml培養(yǎng)瓶(Falcon產(chǎn)品)的底部，擰緊瓶蓋放置超凈工作臺(tái)中靜止10 min，再沿培養(yǎng)瓶邊緣緩緩加入AminoMAX羊水完全培養(yǎng)基(GIBCO產(chǎn)品)4 ml，使其覆蓋細(xì)胞懸液，置37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 d后更換培養(yǎng)液并在倒置顯微鏡下每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，直至收獲。

1.2.3 細(xì)胞收獲及制片 當(dāng)顯微鏡下見貼壁生長(zhǎng)的羊水細(xì)胞形成較大的克隆，并出現(xiàn)成對(duì)的圓形透亮細(xì)胞時(shí)，即可進(jìn)行細(xì)胞收獲。收獲前加入20μg/ml的秋水仙素(湖南湘雅基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品)3滴，使終濃度達(dá)到0.2μg/ml，作用2 h后，倒去培養(yǎng)瓶上清，加入0.25%胰蛋白酶(Sigma產(chǎn)品)2 ml，37℃水浴箱消化5 min，用細(xì)胞刮刀將貼壁細(xì)胞刮下，再用吸管反復(fù)吹打數(shù)次，將細(xì)胞懸液移入離心管，進(jìn)行離心、低滲、固定等步驟，按本室常規(guī)方法染色體制片。

1.2.4 染色體G顯帶及核型分析 制備好的玻片，置75℃烤箱中烤片3 h，0.05%胰酶消化，Giemsa染色顯帶。按照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制(ISCN 1995)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行核型分析診斷。常規(guī)計(jì)數(shù)20個(gè)分裂相，分析5個(gè)分散良好的核型，異常核型加倍計(jì)數(shù)40個(gè)分裂相。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果 238例孕婦的羊水細(xì)胞培養(yǎng)，一次羊膜腔穿刺即培養(yǎng)成功227例，成功率為95.4%。11例初次培養(yǎng)失敗孕婦有4例進(jìn)行了二次羊穿，全部培養(yǎng)成功，總成功率為97.1%。剩余7例培養(yǎng)失敗中分析其原因，有1例為胎糞污染、4例細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)不良、2例孕周偏大(＞25周)。羊水細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間最短6 d收獲，最長(zhǎng)10 d收獲，大部分羊水細(xì)胞在培養(yǎng)第7天，可見較多的克隆貼壁旺盛的生長(zhǎng)，是收獲的最佳時(shí)機(jī)，見圖1。

圖1 羊水細(xì)胞培養(yǎng)第7天(10×20)Fig1 Amniotic fluid cells cultured for 7 days

2.2 染色體核型分析結(jié)果 在成功培養(yǎng)的231例羊水中共發(fā)現(xiàn)8例染色體異常，異常率占3.5%。其中發(fā)現(xiàn)21三體2例、18三體1例、Turner綜合征2例、Klinefelter綜合征1例、結(jié)構(gòu)異常1例，嵌合體1例;另外，發(fā)現(xiàn)染色體多態(tài)性4例，分別為Yqh+2例，9qh+1例，16qh+1例。其余染色體核型均為正常。8例異常染色體結(jié)果及胎兒結(jié)局見表1。

表1 8例異常染色體核型分析結(jié)果及胎兒結(jié)局Tab1 8 cases of abnormal karyotype results and fetal outcomes

2.3 典型的染色體核型分析圖 見圖2、3。

圖2 18三體染色體核型圖(箭頭所示為18號(hào)染色體，10×100)Fig2 Trisomy of18 karyotype map(the arrow shows the chromosome 18，10 ×100)

圖3 21三體染色體核型圖(箭頭所示為21號(hào)染色體，10×100)Fig3 Trisomy of 21 karyotype map(the arrow shows the chromosome 21，10 ×100)

3 討論

自1966年Steele首次報(bào)道羊水細(xì)胞培養(yǎng)成功并應(yīng)用于臨床胎兒染色體疾病的產(chǎn)前診斷以來(lái)，至今此項(xiàng)技術(shù)仍是產(chǎn)前診斷染色體病最安全、經(jīng)濟(jì)和有效的方法［2］。但羊水細(xì)胞培養(yǎng)是一項(xiàng)技術(shù)要求高、難度大、培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、分裂相較少、成功率不穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目［3－4］。我們?cè)谘蛩囵B(yǎng)過程中對(duì)標(biāo)本采集、細(xì)胞接種、收獲制片等環(huán)節(jié)做了一些探討和改良，獲得了較為滿意的結(jié)果。238例羊水有231例培養(yǎng)獲得成功，總成功率達(dá)97.1%?，F(xiàn)將經(jīng)驗(yàn)總結(jié)如下。

首先，在標(biāo)本采集方面，羊膜腔穿刺是有創(chuàng)性操作，穿刺前應(yīng)做好準(zhǔn)備工作，穿刺時(shí)做到嚴(yán)格無(wú)菌，一旦被細(xì)菌污染，不僅導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，而且對(duì)孕婦和胎兒也會(huì)造成感染和流產(chǎn)的危險(xiǎn)［5］。其次，在標(biāo)本接種方面，我們做了以下的改良，20 ml羊水分成2管離心接種2個(gè)培養(yǎng)瓶，離心后留取較多的細(xì)胞懸液(1 ml)進(jìn)行接種。由于羊水細(xì)胞在制取過程中容易丟失，我們把羊水細(xì)胞懸液直接接種于培養(yǎng)瓶底部，經(jīng)過一段時(shí)間(10 min)靜置后再加入培養(yǎng)基培養(yǎng)，使細(xì)胞提前集中貼壁，減少丟失，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有效細(xì)胞克隆形成更早更多。這種改進(jìn)不僅提高了培養(yǎng)的成功率，而且延長(zhǎng)了羊水采集的孕周。一般認(rèn)為，羊水標(biāo)本采集在孕16～22周為宜，此時(shí)羊水中含有的活性細(xì)胞最多［6－7］。但我們的培養(yǎng)方法在 ＞22周羊水標(biāo)本中也有5例獲得了培養(yǎng)成功。最后，收獲時(shí)機(jī)的把握是制得良好核型的關(guān)鍵。羊水細(xì)胞平均貼壁時(shí)間約為5～7 d，開始貼壁多見胎兒上皮樣細(xì)胞及梭長(zhǎng)形羊水細(xì)胞(AF細(xì)胞)，形成的細(xì)胞克隆覆蓋1個(gè)或1個(gè)以上的完整視野進(jìn)行換液，當(dāng)培養(yǎng)瓶中有較多的細(xì)胞克隆，周邊細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，存在有較多的圓形或雙圓形透亮細(xì)胞，為最佳收獲時(shí)機(jī)。

231例羊水染色體核型分析共發(fā)現(xiàn)8例異常，異常率占 3.5%，異常率與國(guó)內(nèi)有關(guān)報(bào)道相近［8－9］。發(fā)現(xiàn)染色體非整倍體6例，包括21三體2例、18三體1例、Turner綜合征2例、Klinefelter綜合征1例。染色體非整倍體是活產(chǎn)嬰兒中發(fā)病率較高的染色體疾病，均會(huì)造成新生兒發(fā)生嚴(yán)重的出生缺陷。6例非整倍體嬰兒，經(jīng)驗(yàn)證和孕婦同意后均做了引產(chǎn)手術(shù)，有效地避免了非整倍體嬰兒的出生。231例羊水分析還發(fā)現(xiàn)了染色體結(jié)構(gòu)異常1例［46，XY，t(2p，7q)］以及嵌合體 1 例(46，XX/69，XXX)。染色體結(jié)構(gòu)異常的胎兒來(lái)源于其父親的平衡易位，并不引起遺傳物質(zhì)量的丟失。由于其父親表型正常，經(jīng)孕婦同意，該嬰兒得以保留，出生后未見表型異常。羊水嵌合體的胎兒的處理需要謹(jǐn)慎［10］，本例經(jīng)臍帶血穿刺驗(yàn)證后為假性嵌合，胎兒出生后也未見異常。另外，我們還發(fā)現(xiàn)染色體多態(tài)性4例，分別為Yqh+2例，9qh+1例，16qh+1例，均為人類染色體的異態(tài)性，同樣這些胎兒均予以了保留。通過對(duì)已娩出的新生兒電話隨訪，胎兒出生后均表型正常且性別完全吻合。

［1］朱俊真，張寧，彭彥輝.產(chǎn)前診斷學(xué)［M］.北京:中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，2005:24－37.

［2］許爭(zhēng)峰，胡婭莉，朱瑞芳.高效羊水細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2006，41(4):275－276.

［3］魯莉萍，陳意振，張莉超.羊水細(xì)胞培養(yǎng)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用－619例染色體核型分析［J］.中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2005，13(5):32－33.

［4］宋麗君.人羊水細(xì)胞染色體制備成敗的影響因素［J］.中國(guó)誤診學(xué)雜志，2008，8(12):2870－2871.

［5］周容.介入性產(chǎn)前診斷［J］.實(shí)用婦產(chǎn)科雜志，2008，24(1):10－11.

［6］陸國(guó)輝.產(chǎn)前遺傳病診斷［M］.廣州:廣東科技出版社，2002:175.

［7］葉四云，叢林，付娟娟，等.羊水細(xì)胞胎兒染色體分析及其在產(chǎn)前診斷中的意義［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45(2):272－274.

［8］榻潔甜，梁彩紅，林蔚，等.798例妊娠中期羊水細(xì)胞染色體核型分析［J］.廣州醫(yī)藥，2009，40(6):31－33.

［9］齊漫龍，阮強(qiáng)，吳斌，等.928例孕中期羊水細(xì)胞染色體核型分析［J］.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，37(3):367－368.

［10］邵敏杰，高雪峰，李丹，等.羊水細(xì)胞培養(yǎng)中的嵌合現(xiàn)象對(duì)產(chǎn)前診斷的意義［J］.中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2009，17(1):41－42.