哺乳動物卵母細胞退化機制＊

徐海琦 林輝榮 吳春麗 徐營（嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興 314001）

卵母細胞是哺乳動物體內(nèi)最大的一種細胞，承載著繁衍后代的使命，而卵子的發(fā)育成熟是其完成生殖過程的先決條件。對卵泡的生長、發(fā)育和卵子成熟調(diào)控機制的研究一直是發(fā)育生物學(xué)的研究熱點之一。

卵母細胞來源于原始生殖細胞（Primordial germcells，PGC），胚胎發(fā)育期間，PGC進入生殖嵴不斷生長發(fā)育，在出生前后停滯在第一次減數(shù)分裂前期（即初級卵母細胞），直到性成熟才恢復(fù)減數(shù)分裂。初級卵母細胞被一層卵泡顆粒細胞包圍，構(gòu)成原始卵泡。性成熟期，原始卵泡啟動發(fā)育，形成初級卵泡，進一步發(fā)育成次級卵泡及最后的成熟卵泡。成熟卵泡隨之破裂，發(fā)生排卵，此時的卵細胞為具有受精能力的成熟卵母細胞。卵泡發(fā)育期間，卵母細胞周圍的顆粒細胞也不斷增殖和分化［1］（如圖）。

圖1 卵母細胞與周圍體細胞的相互作用

1 卵母細胞的發(fā)育、成熟階段

這是一個非常復(fù)雜的動態(tài)過程，它主要由2方面的因素調(diào)控。一方面通過卵巢內(nèi)微環(huán)境中的細胞因子調(diào)控，另一方面是通過下丘腦—垂體—卵巢所釋放的激素調(diào)控，即中樞神經(jīng)內(nèi)分泌進行調(diào)節(jié)。生長因子對卵母細胞成熟的作用是正向的。發(fā)育卵泡中存在多種促生長因子及其受體，它們同時影響卵膜細胞和顆粒細胞的增殖和分化，并參與調(diào)節(jié)卵母細胞的成熟。卵巢內(nèi)微環(huán)境局部的卵泡膜細胞、顆粒細胞以及卵母細胞等產(chǎn)生的自分泌和旁分泌調(diào)節(jié)因子，直接調(diào)控卵子的發(fā)育和成熟。研究表明，卵巢組織內(nèi)合成分泌的白細胞介素（Interleukin，IL）［2］、胰島素樣生長因子－1（Insulin－like growth factor－1，IGF－1）［3］、表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）［4］、轉(zhuǎn)化生長因子－β（Transforming growth factor－β，TGF－β）［5］、生長分化因子－9（Growth differentiation factor－9，GDF－9）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白－15（bone morphogenetic protein－15，BMP－15）［6］、成熟促進因子（M－phase promoting factor，MPF）［7］等多種非激素類分子參與調(diào)節(jié)卵細胞的發(fā)育與成熟過程。近年來，隨著分子生物學(xué)的研究進展，圍繞絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase，MAPK）信號通路［8］、G蛋白耦聯(lián)受體介導(dǎo)的信號通路、受體酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinase－Ras，RTK－Ras）信號通路、磷脂酰肌醇3－激酶（Phospho－inositide 3－kinases，PI3K）－蛋白激酶B（Protein kinase B，PKB或 Akt）信號通路、TGF－β信號通路、Wnt信號通路等在卵細胞發(fā)育成熟過程中的作用，也進行了較為系統(tǒng)的研究。

卵母細胞成熟抑制因子（OMI）是指卵泡液中能夠抑制卵母細胞成熟的物質(zhì)。OMI是一個多肽，分子量約為1～2kDa，許多哺乳動物卵巢的卵泡液中均存在，并且在卵母細胞體外培養(yǎng)中可阻止自發(fā)減數(shù)分裂成熟。目前研究較多的成熟抑制因子有環(huán)核苷酸和嘌呤。FST主要在卵巢的顆粒細胞中合成，而顆粒細胞又是與卵母細胞直接接觸的唯一的細胞，因此，F(xiàn)ST在卵母細胞的成熟與退化過程上起著非常重要的作用。FST可以通過調(diào)節(jié)卵巢顆粒細胞的分化和成熟，并與活化相互作用，影響卵泡發(fā)育與閉鎖，繼而影響卵母細胞成熟過程［9］。

另一方面是通過下丘腦—垂體—卵巢所釋放的激素調(diào)控，即中樞神經(jīng)內(nèi)分泌進行調(diào)節(jié)。激素是促進卵母細胞成熟的重要物質(zhì)，如促性腺激素、性激素及類固醇激素等［10－12］。激素是哺乳動物卵母細胞成熟的重要物質(zhì)。目前，絕大多數(shù)研究者在卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)過程中，添加促性腺激素或類固醇激素或兩者的混合物。但是，它們在卵母細胞體外成熟過程中的作用及作用機理尚未清楚。根據(jù)已有的研究結(jié)果推測，激素誘導(dǎo)卵母細胞恢復(fù)減數(shù)分裂可能通過2條途徑：①誘導(dǎo)卵丘擴散使顆粒細胞與卵母細胞的間隙連接中斷，使卵丘細胞的信息不能傳入卵母細胞，從而解除卵丘細胞對卵母細胞恢復(fù)減數(shù)分裂的抑制作用，重新啟動減數(shù)分裂。②誘導(dǎo)卵丘細胞產(chǎn)生一些刺激因子，克服抑制物質(zhì)的作用而恢復(fù)減數(shù)分裂?，F(xiàn)在，體外成熟培養(yǎng)中，主要以添加LH和hCG為主。Funashi等的研究表明，在豬卵母細胞體外成熟時，培養(yǎng)的前20h加入激素，培養(yǎng)20h后去掉激素，可增加卵母細胞體外成熟率，促進卵母細胞的減數(shù)分裂和細胞質(zhì)成熟。同時指出，在豬卵母細胞體外成熟中，有兩個關(guān)鍵步驟是受激素調(diào)節(jié)的。一是核成熟，它可由培養(yǎng)的前20h加入激素所激發(fā)；二是細胞質(zhì)成熟，在培養(yǎng)的后20 h去掉一部分或全部激素可以促進細胞質(zhì)的成熟［13］。Delos－Reyes［14］等的研究也發(fā)現(xiàn)，在豬卵母細胞體外培養(yǎng)的第2階段去掉激素可以提高卵母細胞的體外成熟率。

有研究報道，豬卵母細胞的體外成熟伴隨卵丘細胞的擴散，擴散的卵丘細胞能夠調(diào)節(jié)諸如氨基酸、核苷酸、磷脂酸、激素、蛋白質(zhì)等物質(zhì)在卵母細胞內(nèi)外的進出，誘導(dǎo)卵母細胞排出有害因子，從而有效地抑制卵母細胞的退化［15－16］。卵母細胞在生長發(fā)育中所釋放的生長因子對卵丘細胞的生長也有一定的促進作用，卵母細胞與卵丘細胞的這種相互作用使得兩者共同發(fā)育生長，最終促進了卵母細胞的成熟。

2 卵母細胞退化機制

減數(shù)分裂紊亂以及細胞分裂基因的表達異常是人類以及其他高齡哺乳動物卵母細胞退化的主要機制之一。卵母細胞的減數(shù)分裂是由很多因子參與的精確、有序的調(diào)節(jié)過程，其中后期同源染色體／姐妹染色單體的分離對于維持基因組的完整性起重要作用，其分離缺陷會引起非整倍性，并導(dǎo)致出生缺陷。Hassold等研究認為卵母細胞的質(zhì)量低下、數(shù)量下降，由減數(shù)分裂錯誤引起的卵母細胞質(zhì)量下降是與衰老相關(guān)生育力下降的主要原因之一［17－19］，即發(fā)生了與年齡相關(guān)的卵母細胞退化。卵母細胞退化是衰老造成母源性生育力下降的主要因素。

Tarín的實驗表明，老化的卵母細胞受精產(chǎn)生的后代繁殖性能和壽命均下降［20］?？梢?，老化的卵母細胞對后代產(chǎn)生了嚴重負面影響。然而是什么機制導(dǎo)致了排卵后卵母細胞的老化，卵母細胞在老化過程中究竟發(fā)生了哪些變化是目前研究的熱點。

老齡動物的卵母細胞恢復(fù)減數(shù)分裂前在卵巢內(nèi)停滯很長時間，這漫長的時間里，各種各樣內(nèi)在和外源的因素可以引起紡錘體前體的降解和染色體損傷，其中與線粒體有關(guān)的氧化應(yīng)激是一主要因素。Friedman等［21］報道隨年齡而增加，缺氧直接引起或再充氧后間接引起氧化應(yīng)激產(chǎn)生。氧化應(yīng)激損傷衰老期間的DNA和染色體及蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可能涉及到對紡錘體組裝重要的微管和小分子。許多染色體相關(guān)或著絲粒相關(guān)的蛋白質(zhì)，如Mps1、Mad2和Xkid，已表明在染色體于紡錘體中期板上的排列發(fā)揮重要作用［22］?？傊?，老齡個體減數(shù)分裂異常可能是許多因素損傷了紡錘體和染色體成分和／或改變了減數(shù)分裂各時期的時序，導(dǎo)致紡錘體紊亂和染色體排列異常。卵母細胞在遺傳學(xué)及生物學(xué)方面受到年齡的影響，其中由分裂錯誤所導(dǎo)致的非整倍性增加和染色單體早現(xiàn)被認為與衰老相關(guān)卵母細胞質(zhì)量下降方面起有主要作用。在人，卵母細胞和胚胎非整倍性的比率隨母體年齡增長而顯著增加［23］，Eichenlaub－Ritter［24］統(tǒng)計了4000多個老齡人的 MⅡ期卵母細胞，其中8.6%為超倍性，13.5%為低倍性，因此保守的估計（非整倍性相當(dāng)于2倍超倍體的水平）有17.2%的卵母細胞染色體異常，在估計整個非整倍性水平時若也算上低倍性則有20%以上的卵母細胞染色體異常?？紤]到MⅡ期卵母細胞的非整倍性僅反映了第一次減數(shù)分裂錯誤的程度，完成第二次減數(shù)分裂后非整倍性的比率在老齡個體會更高。Eichenlaub－Ritter等［25］報道老齡小鼠MⅡ期卵母細胞染色體數(shù)異常的比例顯著高于年輕小鼠，同時高比例（P＜0.001）的老齡小鼠卵母細胞在 MⅡ期含一條或幾條染色單體。

現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)了許多與卵母細胞退化相關(guān)的基因。這些基因包括 GDF29、Fac、AtrPAtm、Mlh1、Zfx、ER、Cyclin D2、Connexin 37、bcl－2、ob、c－mos、p27〔kip1〕、C／ERPbeta、Hook等，它們的特征表現(xiàn)為以下幾個方面：①影響卵巢發(fā)育及卵泡成熟，如p27〔Kip1〕、c－mos，敲除這些基因?qū)?dǎo)致排卵數(shù)的下降，但有關(guān)的調(diào)控機理目前尚不清楚；②調(diào)控細胞周期并影響卵母細胞的減數(shù)分裂，如AtrPAtm，它們分別定位于減數(shù)分裂中聯(lián)會與非聯(lián)會的染色體上，將它們敲除會導(dǎo)致偶線期P粗線期的阻滯。而缺少c－mos的卵母細胞則會產(chǎn)生異常的紡錘體及錯誤的染色體濃縮，最終導(dǎo)致卵母細胞MⅡ期阻滯的失敗，激活孤雌生殖；③對激素調(diào)控起作用，如ER等；④與染色體分離和微管骨架有關(guān)。Hamatani等［26］研究發(fā)現(xiàn)隨著母親年齡增大，Cggbp1等與染色體分離及微管骨架有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄下降。

通過對酵母的研究發(fā)現(xiàn)，粘著蛋白（Cohesin）可以調(diào)節(jié)染色體的正確分離，姐妹染色單體是靠粘著蛋白形成的粘著力緊密的連在一起，在S期與姐妹染色單體結(jié)合，在中期向后期過度時從染色體上解離的。2001年Dobie等人研究發(fā)現(xiàn)了wapl基因與染色體的分離有關(guān)，但具體機制并不是很清楚。突變的wapl基因在異染色質(zhì)區(qū)域阻止了姐妹染色單體的正常靠近和并列，但是不影響染色體的凝集和分離。wapl基因在有絲分裂的異染色質(zhì)區(qū)域?qū)τ诰S持姐妹染色單體的粘連起著非常重要的作用，具有調(diào)節(jié)染色體遺傳的功能。在293T細胞wapl的過表達使細胞早熟姐妹染色單體分離頻率增高，引起非整倍的產(chǎn)生。wapl缺失后細胞就短暫的停滯在前中期，姐妹染色單體分離率下降，并在后期出現(xiàn)多分裂核現(xiàn)象，同時粘著蛋白表達量也增加。許多染色體相關(guān)或著絲粒相關(guān)的蛋白質(zhì)，如 Mps1、Mad2已表明在染色體于紡錘體中期板上的排列發(fā)揮重要作用。而在卵母細胞成熟發(fā)育過程中，染色體的分離依賴于紡錘體，若紡錘體出現(xiàn)異常，細胞分裂就不能正常完成，從而卵子就不能進行正常受精、卵裂。

減數(shù)分裂異常是卵母細胞退化的一種顯著特征。低質(zhì)量的卵母細胞影響減數(shù)分裂中染色體的分離，導(dǎo)致胚胎在附植前后丟失或產(chǎn)生三倍體，進而影響人類及其他哺乳動物的生育。有證據(jù)表明老齡動物卵母細胞在第二次減數(shù)分裂時也出現(xiàn)異常。Liu等發(fā)現(xiàn)MⅡ期結(jié)束時非整倍體的比率在老齡鼠中明顯升高，這表明染色體的錯誤分離在減數(shù)分裂期也有發(fā)生，而且確實與母親年齡相關(guān)。此外，Battaglia與Volarcik等發(fā)現(xiàn)，與年輕女性的卵母細胞相比，中老年婦女的MⅡ期卵母細胞紡錘體更松散，而且染色體與紡錘體在不同的位點無規(guī)則地相連。

3 展望

綜合以上所述，衰老導(dǎo)致的哺乳動物卵母細胞發(fā)育成熟過程及體外老化過程中所發(fā)生的變化，尤其是細胞分裂（減數(shù)分裂）相關(guān)分子表達變化的研究方面還處于起步階段，存在諸多的未知未明之處，有待于進行進一步的研究。

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