野油菜黃單胞菌胞內(nèi)粗酶液催化合成α-熊果苷

張欣英，嚴(yán) 偉，李群良，姚評佳，魏遠(yuǎn)安，唐紀(jì)良

(1.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西大學(xué) 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004)

熊果苷(Arbutin)，又名熊果甙、熊果素、熊果葉甙、熊果酚甙或楊梅甙，是一種源于杜鵑花科熊果屬的多年生常綠小灌木植物熊果的葉子的成分。熊果苷具有美白活性，廣泛應(yīng)用于化妝品行業(yè)[1]，其美白機(jī)理為熊果苷對酪氨酸酶產(chǎn)生競爭性及可逆性抑制，從而阻斷多巴及多巴醌的合成，進(jìn)而抑制黑色素的生成，達(dá)到美白效果[2]。熊果苷依結(jié)構(gòu)不同可分為α型(4-羥苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷)和β型(4-羥苯基-β-2-D-吡喃葡萄糖苷)，α-熊果苷是β-熊果苷的差向異構(gòu)體,α-熊果苷抑制黑色素的活性為β-熊果苷的10倍[3]。作為最好、最安全的高效美白劑，α-熊果苷在國際化妝品領(lǐng)域占有極其重要的地位，而我國α-熊果苷的開發(fā)和利用仍處于起步階段。因此，研究α-熊果苷的合成意義重大[4]。

目前制備α-熊果苷的方法主要有微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化法和酶法，其中微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化法是利用不同微生物的酶進(jìn)行糖轉(zhuǎn)移反應(yīng),使1分子的葡萄糖和1分子的氫醌結(jié)合形成單一的α-熊果苷[5，6]，但酶法合成α-熊果苷更具優(yōu)勢，如王秀捧等[7]、劉春巧等[8]利用嗜麥芽黃單胞菌(Xanthomonasmaltophilia) BT-112催化合成α-熊果苷。

作者在此利用野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestrispv.campestris) 8004胞內(nèi)粗酶液生物催化合成α-熊果苷，并對反應(yīng)條件進(jìn)行了初步研究。其反應(yīng)方程式為：

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種、試劑與培養(yǎng)基

野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestrispv.campestris) 8004 由廣西亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室唐紀(jì)良教授提供；α-熊果苷，Sigma 公司；生化試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其它試劑均為分析純。

種子培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度，％)：蔗糖1.0，蛋白胨0.5，牛肉膏0.3，酵母膏0.1，pH值7.0。

1.2 野油菜黃單胞菌胞內(nèi)粗酶液的制備

無菌條件下，取一環(huán)菌種于種子培養(yǎng)液中在28 ℃、180 r·min-1下發(fā)酵培養(yǎng)12 h后，吸取發(fā)酵液，于新種子培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，冷凍離心(8000 r·min-1，20 min),收集菌體;用緩沖溶液洗滌菌體2次，低溫超聲破碎，離心；取上清液，即為胞內(nèi)粗酶液(濕菌體濃度為50 mg·mL-1)。

1.3 α-熊果苷的生物合成

取胞內(nèi)粗酶液5 mL，加入反應(yīng)物蔗糖和對苯二酚，于35 ℃、180 r·min-1下?lián)u床反應(yīng)24 h。按下式計(jì)算對苯二酚的轉(zhuǎn)化率(x1)和選擇性(x2)：

式中：M1為加入到反應(yīng)液中的對苯二酚的物質(zhì)的量；M2為反應(yīng)消耗掉的對苯二酚的物質(zhì)的量；M3為對應(yīng)生成α-熊果苷的對苯二酚的物質(zhì)的量。

1.4 α-熊果苷的檢測

取1 mL反應(yīng)液，離心，取上清液，進(jìn)行高效液相色譜檢測。

色譜條件如下：色譜柱為DiamonsilTMC18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；紫外檢測器;柱溫25 ℃；流動(dòng)相為 H2O-CH3OH(95∶5，體積比);流速1 mL·min-1；檢測波長280 nm;進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC譜圖

α-熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品與反應(yīng)液的HPLC圖譜見圖1。

由圖1可看出，反應(yīng)液中出峰時(shí)間為9.306 min，與α-熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間(9.304 min)幾乎相同。這表明野油菜黃單胞菌胞內(nèi)粗酶液能催化對苯二酚與蔗糖反應(yīng)生成α-熊果苷。

2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.2.1 對苯二酚濃度對反應(yīng)的影響(圖2)

圖2 對苯二酚濃度對反應(yīng)的影響

由圖2可知，α-熊果苷含量、對苯二酚的選擇性及轉(zhuǎn)化率均隨著對苯二酚濃度的增大先升高后降低；當(dāng)對苯二酚濃度為40 mmol·L-1時(shí)，α-熊果苷含量、對苯二酚的選擇性及轉(zhuǎn)化率均達(dá)到最高。這可能是因?yàn)椋瑢Ρ蕉訚舛冗^高，抑制了葡糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性。因此，確定最佳對苯二酚濃度為40 mmol·L-1。

2.2.2 反應(yīng)物摩爾比對反應(yīng)的影響

理論上，對苯二酚與蔗糖合成α-熊果苷的反應(yīng)中反應(yīng)物摩爾比應(yīng)該是1∶1，但該反應(yīng)是一個(gè)可逆反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)原理，增加一種反應(yīng)物的量可以提高另一種反應(yīng)物的轉(zhuǎn)化率。考慮到增加對苯二酚濃度會(huì)抑制葡糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性，所以本實(shí)驗(yàn)通過增加蔗糖的量來提高對苯二酚的轉(zhuǎn)化率，從而提高α-熊果苷的產(chǎn)量。反應(yīng)物摩爾比(對苯二酚與蔗糖摩爾比，下同)對反應(yīng)的影響見圖3。

圖3 反應(yīng)物摩爾比對反應(yīng)的影響

由圖3可知，α-熊果苷含量、對苯二酚的選擇性及轉(zhuǎn)化率均隨著反應(yīng)物摩爾比的減小(即蔗糖用量的增加)先升高后降低；當(dāng)反應(yīng)物摩爾比為1∶30時(shí)，α-熊果苷含量、對苯二酚的選擇性及轉(zhuǎn)化率均達(dá)到最高。這可能是因?yàn)?，?dāng)對苯二酚與蔗糖的摩爾比小于1∶30時(shí)，胞內(nèi)粗酶液中的其它酶競爭底物蔗糖進(jìn)行其它的催化反應(yīng)，從而使其對應(yīng)生成α-熊果苷的量、對苯二酚的選擇性及轉(zhuǎn)化率均下降。因此，確定最佳反應(yīng)物摩爾比(對苯二酚與蔗糖摩爾比)為1∶30。

2.2.3 緩沖溶液pH值對反應(yīng)的影響(圖4)

圖4 緩沖溶液pH值對反應(yīng)的影響

由圖4可知，α-熊果苷含量、對苯二酚的選擇性及轉(zhuǎn)化率均隨pH值的增大先升高后降低；當(dāng)pH值為7.0時(shí)，α-熊果苷含量、對苯二酚的選擇性及轉(zhuǎn)化率均達(dá)到最高。這是因?yàn)椋琾H值影響著酶的活性，酶在最適pH值下可以發(fā)揮最大的活性。在本催化反應(yīng)中，pH值不僅影響葡糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性，也影響底物對苯二酚的結(jié)構(gòu)變化，pH值為堿性時(shí)會(huì)導(dǎo)致對苯二酚的氧化，增強(qiáng)對葡糖基轉(zhuǎn)移酶的抑制作用，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率的降低。因此，確定最佳緩沖溶液pH值為7.0。

2.2.4 反應(yīng)時(shí)間對反應(yīng)的影響(圖5)

圖5 反應(yīng)時(shí)間對反應(yīng)的影響

由圖5可知，α-熊果苷含量、對苯二酚的選擇性及轉(zhuǎn)化率均隨反應(yīng)時(shí)間的延長先升高后降低；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為36 h時(shí)，α-熊果苷含量、對苯二酚的選擇性及轉(zhuǎn)化率均達(dá)到最高；隨著反應(yīng)時(shí)間的繼續(xù)延長，α-熊果苷含量、對苯二酚的選擇性及轉(zhuǎn)化率都有所下降。這可能是因?yàn)?，反?yīng)時(shí)間過長，粗酶液中的其它酶競爭底物蔗糖催化其它反應(yīng)，降低了底物濃度，使蔗糖與對苯二酚合成α-熊果苷的反應(yīng)逆向進(jìn)行；同時(shí)對苯二酚濃度的提高也抑制葡糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性。因此，確定最佳反應(yīng)時(shí)間為36 h。

2.2.5 菌體濃度對反應(yīng)的影響

理論上，出發(fā)菌體濃度越大，其所含的酶量也越多，即反應(yīng)催化劑量越大，在其它反應(yīng)條件不變的情況下，底物的轉(zhuǎn)化率也應(yīng)該越大。菌體濃度對反應(yīng)的影響見圖6。

圖6 菌體濃度對反應(yīng)的影響

由圖6可知，隨著菌體濃度的增大，α-熊果苷含量、對苯二酚的選擇性及轉(zhuǎn)化率也明顯上升；當(dāng)菌體濃度超過80 mg·mL-1時(shí)，α-熊果苷含量、對苯二酚的選擇性及轉(zhuǎn)化率上升幅度不明顯。因此，確定最佳菌體濃度為80 mg·mL-1。此時(shí)，α-熊果苷含量達(dá)到6.58 mg·mL-1、對苯二酚選擇性為66％、對苯二酚轉(zhuǎn)化率為91％。

3 結(jié)論

(1)確定野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestrispv.campestris) 8004胞內(nèi)粗酶液生物催化合成α-熊果苷的最佳反應(yīng)條件如下：反應(yīng)溫度35 ℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r·min-1、對苯二酚濃度40 mmol·L-1、對苯二酚與蔗糖的摩爾比1∶30、緩沖溶液pH值7.0、反應(yīng)時(shí)間36 h、菌體濃度80 mg·mL-1，在此條件下，α-熊果苷含量達(dá)到6.58 mg·mL-1、對苯二酚選擇性為66％、對苯二酚轉(zhuǎn)化率為91％。

(2)以蔗糖為供糖基底物，通過生物酶法催化合成α-熊果苷，與化學(xué)合成法相比，避免了原料成本高、合成路線長、工藝流程復(fù)雜、消耗大等缺點(diǎn)，在生產(chǎn)成本、對環(huán)境的影響、產(chǎn)品安全性方面均更具優(yōu)勢。

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