RAW264.7細(xì)胞與脂類代謝關(guān)系的研究進(jìn)展

趙麗麗，田慶龍，馮毅凡

(廣東藥學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006)

脂類物質(zhì)是生物體的能量提供者，參與了大量的生命活動(dòng)，具有非常重要的生理功能，包括維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、能量?jī)?chǔ)藏、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和載體等[1]。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)2003年資助的“脂質(zhì)代謝途徑研究計(jì)劃”(Lipid metabolites and pathways strategy，LIPID MAPS)項(xiàng)目提出的脂質(zhì)分類系統(tǒng)(The LIPID MAPS lipid classification system)，將脂質(zhì)大體分為8大類，見表1[2]。

表1 脂質(zhì)的分類、縮寫及數(shù)據(jù)庫中收錄的數(shù)目

由于脂類分子具有多種生物功能，脂類代謝網(wǎng)絡(luò)的紊亂可引起多種疾病的發(fā)生，如動(dòng)脈粥樣硬化[3]、冠心病[4]、阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease)[5]、肥胖病[6]、腦損傷[7]、癌癥[8]、疼痛和炎癥[9]、糖尿病[10]等。測(cè)定脂類分子組成的改變、含量水平的變化、空間異質(zhì)性和代謝轉(zhuǎn)換(Metabolic turnover)有助于解釋疾病中脂質(zhì)的作用。

1 RAW264.7細(xì)胞與脂類物質(zhì)的關(guān)系

1.1 RAW264.7細(xì)胞中脂類物質(zhì)的含量

與其它哺乳細(xì)胞一樣，作為生命的基本單位，RAW264.7細(xì)胞中包含著眾多細(xì)胞器，每個(gè)細(xì)胞器都有其特定的功能。每個(gè)亞細(xì)胞膜上都存在著如細(xì)胞膜小凹和脂筏等微區(qū)域，共同調(diào)控著細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。哺乳細(xì)胞膜是由蛋白質(zhì)和脂質(zhì)分子組成的，其中蛋白質(zhì)占膜質(zhì)量的70%，其余為脂質(zhì)分子。在多數(shù)哺乳細(xì)胞中，甘油磷脂類約占整個(gè)脂類分子的60%(以物質(zhì)的量計(jì))，糖脂類和神經(jīng)鞘脂類約占整個(gè)脂類分子的10%，非極性脂(包括甘油三酯和膽固醇)在不同細(xì)胞類型和亞細(xì)胞間隔中分布范圍為0.1%～40%，類脂代謝物(如游離脂肪酸、溶血磷脂、甘油二酯、神經(jīng)酰胺等)占整個(gè)脂類分子的比例不到5%，但它們?cè)跈C(jī)體病變條件下能夠聚集并產(chǎn)生有害的病理特征。數(shù)以千計(jì)的脂質(zhì)分子組成了生物膜脂雙層[11]。研究表明，哺乳動(dòng)物細(xì)胞含有1000～2000種脂質(zhì)，而且隨著新技術(shù)、新方法的不斷發(fā)展，各種新的脂質(zhì)分子還在不斷地被發(fā)現(xiàn)[12]。

1.2 RAW264.7細(xì)胞中脂類物質(zhì)的分布

脂雙層兩側(cè)的脂類物質(zhì)的組分是不同的。其中，磷脂酰膽堿(PC)、神經(jīng)鞘磷脂(SM)和膽固醇主要位于膜外側(cè)面，而磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰絲氨酸(PS)主要位于膜胞漿側(cè)。多個(gè)亞細(xì)胞器和膜微區(qū)域的存在、脂類分子的不均勻分布以及脂類分子相互作用的內(nèi)在動(dòng)力學(xué)使得脂質(zhì)組學(xué)的研究更具吸引力，也更有挑戰(zhàn)性。

1.3 RAW264.7細(xì)胞中主要脂類物質(zhì)的生物學(xué)功能

甘油磷脂類中的磷脂酸(PA)是合成所有磷脂的媒介物，也是哺乳細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子，影響脂類代謝的多個(gè)通路；磷脂酰絲氨酸位于細(xì)胞內(nèi)膜的小葉中，其在細(xì)胞表面出現(xiàn)是細(xì)胞凋亡的特征性標(biāo)志，這對(duì)識(shí)別及清除細(xì)胞凋亡的碎片十分重要；溶血磷脂酸(LPA)在血小板聚集及癌細(xì)胞侵害時(shí)具有一定的生物活性，同時(shí)，也是G蛋白偶聯(lián)受體的天然配體；溶血磷脂酰絲氨酸主要是作為成纖維細(xì)胞趨化性的媒介；縮醛磷脂可以保護(hù)細(xì)胞防止過氧化應(yīng)激；脂肪酸(FA)長(zhǎng)鏈的氧化作為哺乳動(dòng)物能量的來源；固醇類物質(zhì)(類固醇激素、維他命、膽汁酸)等為機(jī)體代謝提供燃料[13，14]；神經(jīng)酰胺與細(xì)胞凋亡有關(guān)；鞘氨醇-1-磷酸能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移。

2 RAW264.7細(xì)胞與脂類代謝的關(guān)系

脂質(zhì)組學(xué)主要研究生物體受外界刺激和疾病干擾后脂類代謝物以及脂類分子相互作用的變化。Hermansson等[15]總結(jié)出哺乳細(xì)胞中脂質(zhì)處于一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)，繪制了在所有的哺乳細(xì)胞中都存在的甘油磷脂的生物合成和代謝的途徑，包括作用的關(guān)鍵酶。脂質(zhì)代謝具有一定的代謝網(wǎng)絡(luò)，而網(wǎng)絡(luò)的紊亂可引起多種疾病的發(fā)生，通過測(cè)定細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)分子的變化(如脂種類、亞種類和單個(gè)脂類分子)、脂質(zhì)分子的動(dòng)態(tài)代謝以及類脂與蛋白質(zhì)的相互作用，人們對(duì)許多疾病有了新的認(rèn)識(shí)。因此脂質(zhì)及其代謝物有望作為健康或疾病狀態(tài)的指征。脂質(zhì)組學(xué)的發(fā)展為藥物開發(fā)、標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)以及疾病的早期診斷提供了新的機(jī)遇[10]。

細(xì)胞是構(gòu)成人體最基本的結(jié)構(gòu)和功能單位，每種細(xì)胞分布于機(jī)體的特定部位，執(zhí)行特殊的功能。RAW264.7細(xì)胞是小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞，屬于小鼠腹腔上皮細(xì)胞，在炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)和吞噬反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[16]。脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，是機(jī)體炎癥和免疫反應(yīng)的強(qiáng)誘導(dǎo)劑，在啟動(dòng)宿主防御細(xì)菌感染的炎癥和免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。巨噬細(xì)胞經(jīng)脂多糖刺激后，可以產(chǎn)生大量金屬基質(zhì)蛋白酶(MMPs)、一氧化氮(NO)、促炎癥因子如腫瘤壞死因子(TNF-α)和白介素-6(IL-6)等，從而引發(fā)炎癥損傷[17]。為了探討該過程中脂質(zhì)代謝通路，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了一系列的研究。

2.1 對(duì)RAW264.7細(xì)胞脂類物質(zhì)代謝通路的研究

美國(guó)加州大學(xué)進(jìn)行了RAW264.7細(xì)胞脂質(zhì)組學(xué)的研究，研究了脂多糖誘導(dǎo)前后的巨噬細(xì)胞中所有脂質(zhì)成分的變化[18]。以RAW264.7 細(xì)胞作為研究對(duì)象，采用一種選擇性激動(dòng)該細(xì)胞的TLR4受體的物質(zhì)Kdo2-Lipid A(一種脂多糖類似物)，誘導(dǎo)細(xì)胞成炎癥模型，系統(tǒng)分析了經(jīng)Kdo2-Lipid A處理后8個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h)內(nèi)，二十四烷酸類、脂肪酸類、甘油脂類、甘油磷脂類、鞘磷脂類及固醇類脂質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明，Kdo2-Lipid A處理后，脂質(zhì)成分發(fā)生了很大的變化，并鑒定出400余種脂質(zhì)分子，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，LIPID MAPS 通過VANTED 軟件繪制了一系列脂質(zhì)代謝途徑，如二十四烷酸類脂質(zhì)代謝途徑、ω-3、ω-6、ω-9 脂肪酸的代謝途徑、含32：0、32：1、34：0、34：1、36：0、36：1、38：0、38：1、38：4 脂肪酸鏈的甘油脂類和甘油磷脂類脂質(zhì)的代謝途徑、部分鞘磷脂類脂質(zhì)代謝途徑、固醇類脂質(zhì)代謝途徑等，并完成了對(duì)哺乳動(dòng)物脂類物質(zhì)的首次定量研究[19]。

2.2 對(duì)RAW264.7細(xì)胞亞細(xì)胞器脂類代謝的研究

脂質(zhì)的功能是由其局部濃度決定的，脂質(zhì)濃度在各細(xì)胞器之間、脂質(zhì)雙分子層的2個(gè)小葉之間、甚至在細(xì)胞膜的側(cè)內(nèi)面都是不同的。研究細(xì)胞脂質(zhì)成分的功能，不僅要確定哪種脂質(zhì)成分是存在的，還要確定每個(gè)特殊細(xì)胞部位的每種脂質(zhì)的濃度及與其相互影響的成分[20]。Andreyev等[16]對(duì)RAW264.7細(xì)胞的亞細(xì)胞器脂質(zhì)成分進(jìn)行了研究，詳細(xì)探討了各亞細(xì)胞器中甘油磷脂類、神經(jīng)鞘脂類、固醇脂類及孕烯醇脂類的提取方法及色譜質(zhì)譜的分析方法，并分析了Kdo2-Lipid A誘導(dǎo)前后RAW264.7細(xì)胞各亞細(xì)胞器中的脂質(zhì)成分，結(jié)果鑒別出163個(gè)甘油磷脂類成分、48個(gè)神經(jīng)鞘脂類成分、13個(gè)固醇脂類成分及5個(gè)孕烯醇脂類成分，并進(jìn)一步證明各亞細(xì)胞器間甘油磷脂類成分明顯不同，邁出了RAW264.7細(xì)胞亞細(xì)胞器脂質(zhì)組學(xué)的第一步。

2.3 對(duì)RAW264.7細(xì)胞花生四烯酸類脂質(zhì)代謝的研究

Gupta等[21]通過建立Kdo2-Lipid A刺激誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞的炎癥模型，研究了基因及藥理學(xué)干預(yù)條件下脂質(zhì)通路的變化，繪制了花生四烯酸類脂質(zhì)在炎癥反應(yīng)中的代謝網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果表明，花生四烯酸類脂質(zhì)在炎癥反應(yīng)中具有重要作用。Buczynski等[22]通過建立同樣的細(xì)胞模型，探討了花生四烯酸合成通路的基因組和脂質(zhì)組的短暫變化，并繪制了基因組及脂質(zhì)組的代謝網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果表明，在Kdo2-Lipid A刺激下，首先促進(jìn)COX途徑的代謝，引起大量COX途徑產(chǎn)物的上調(diào)、5-LOX途徑產(chǎn)物的下調(diào)，表明這些產(chǎn)物在炎癥反應(yīng)中具有重要作用。因此，對(duì)花生四烯酸類脂質(zhì)進(jìn)行分析對(duì)了解其在健康狀態(tài)和炎癥狀態(tài)的作用及對(duì)藥物的開發(fā)都具有重要的意義。

在脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)中，含有二十碳四烯酸碳鏈的甘油磷脂是花生四烯酸的前體物質(zhì)，Rouzer等[23]運(yùn)用質(zhì)譜法測(cè)定了脂多糖誘導(dǎo)前后，與二十碳四烯酸代謝有關(guān)的甘油磷脂的結(jié)構(gòu)和兩種巨噬細(xì)胞(RPMs細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞)的脂質(zhì)組成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)前后甘油磷脂的組成有很大的不同，并與細(xì)胞種類密切相關(guān)，這表明了甘油磷脂的組成在脂質(zhì)介質(zhì)生物合成過程中的重要性。該實(shí)驗(yàn)組隨后又進(jìn)一步進(jìn)行研究[24]，采用酵母多糖誘導(dǎo)該兩種巨噬細(xì)胞，結(jié)果表明，在脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)中，含有二十碳四烯酸碳鏈的磷脂酰膽堿是花生四烯酸的主要來源，而烷?；牧字Ｒ掖及纷鳛橐环N瞬時(shí)來源，可以快速被補(bǔ)充。

2.4 對(duì)RAW264.7細(xì)胞膽固醇代謝的研究

馮旭等[25]以 RAW264.7細(xì)胞為研究對(duì)象，探討人膽固醇脂水解酶(hCEH)在細(xì)胞內(nèi)的瞬時(shí)表達(dá)對(duì)細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝產(chǎn)生的影響，結(jié)果表明，hCEH基因在 RAW264.7細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)，可降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平、抑制泡沫細(xì)胞的形成。Zhou等[26]以RAW264.7細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察對(duì)氧磷對(duì)RAW264.7細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞ABCA1表達(dá)和膽固醇流出的影響并探討其機(jī)制。結(jié)果顯示，對(duì)氧磷以時(shí)間和劑量依賴的方式增加RAW264.7細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中總膽固醇、游離膽固醇和膽固醇脂水平，減少ABCA1表達(dá)和膽固醇流出。陶建等[27]初步探討了整合素β1基因在RAW264.7細(xì)胞攝脂過程中的作用，發(fā)現(xiàn)整合素β1基因明顯影響RAW264.7細(xì)胞的攝脂功能，進(jìn)而影響RAW264.7細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

2.5 對(duì)RAW264.7細(xì)胞磷脂酶代謝的研究

細(xì)胞中磷脂的代謝同時(shí)受G蛋白和酪氨酸激酶的調(diào)控，包括磷脂酶C、D、A1和A2，另外也受到一些脂質(zhì)激酶和磷酸酶的調(diào)節(jié)，這些酶可以將脂質(zhì)成分轉(zhuǎn)化為生物活性的信號(hào)分子，如磷脂酸、甘油二酯和聚磷酸肌醇[28]。Zhang等[29]證實(shí)了經(jīng)脂多糖誘導(dǎo)后的RAW264.7細(xì)胞中磷脂酶的作用。用膽堿磷脂酶C抑制劑和膽堿磷脂酶D抑制劑對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞作用，結(jié)果表明，該兩種抑制劑分別部分抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥因子iNOS和TNF-α的表達(dá)，并抑制甘油二酯和磷脂酸的生成，而合用該兩種抑制劑可以達(dá)到完全阻斷的目的。因此，可以通過膽堿磷脂酶C和膽堿磷脂酶D的活性調(diào)節(jié)脂多糖誘導(dǎo)后的RAW264.7細(xì)胞的脂類代謝。

3 結(jié)語

結(jié)合特定的生命體、組織、體液、細(xì)胞等樣品，進(jìn)行不同層面的脂質(zhì)組(Lipidome)研究，使脂質(zhì)代謝通路的分析具有一定的復(fù)雜性及探索性。LIPID MAPS Networks 主要是整合基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)的研究結(jié)果，嘗試建立某種特定情況下的代謝途徑，是目前研究RAW264.7細(xì)胞脂類代謝最全面的機(jī)構(gòu)，已鑒別出1000多種脂質(zhì)分子，甚至發(fā)現(xiàn)了很多稀少的、以前未確定的磷脂種類。然而，不斷優(yōu)化提取方法、發(fā)展新的技術(shù)和分析方法(如親和探針、生物信息學(xué)等)、探索其它未知的脂質(zhì)成分及可能的代謝通路仍有待研究。另外，已發(fā)現(xiàn)的脂類成分中，花生四烯酸類脂質(zhì)在炎癥反應(yīng)中的作用已經(jīng)明確，但其它脂質(zhì)成分的生物學(xué)功能仍需進(jìn)一步探索。鑒于脂質(zhì)成分與疾病的關(guān)系，探索其與疾病相關(guān)的生物學(xué)功能將有望為疾病的治療尋找到新的靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Bou Khalil M，Hou W，Zhou H，et al.Lipidomics era：Accomplishments and challenges[J].Mass Spectrometry Reviews，2010，29(6):877-929.

[2] Fahy E，Subramaniam S，Murphy R C，et al.Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids[J].Journal of Lipid Research，2009，50(Suppl):S9-S14.

[3] Stein O，Stein Y.Lipid transfer proteins (LTP) and atherosclerosis[J].Atherosclerosis，2005,178(2):217-230.

[4] Tsironis L D，Katsouras C S，Lourida E S，et al.Reduced PAF-acetylhydrolase activity associated with Lp(a) in patients with coronary arterydisease[J].Atherosclerosis，2004，177(1)：193-201.

[5] Walter A，Korth U，Hilgert M，et al.Glycerophosphocholine is elevated in cerebrospinal fluid of Alzheimer patients[J].Neurobiology of Aging，2004，25(10):1299-1303.

[6] Taskinen M R.Type 2 diabetes as a lipid disorder[J].Curr Mol Med，2005，5(3):297-308.

[7] Han X，Yang J，Cheng H，et al.Shotgun lipidomics identifies cardiolipin depletion in diabetic myocardium linking altered substrate utilization with mitochondrial dysfunction[J].Biochemistry，2005，44(50):16684-16694.

[8] Cohen Leonard A.Lipids in cancer：An introduction[J].Lipids，1992，27(10):791-792.

[9] Boggara M B，Krishnamoorti R.Partitioning of nonsteroidal antiinflammatory drugs in lipid membranes:A molecular dynamics simulation study[J].Biophysical Journal，2010，98(4)：586-595.

[10] Wenk M R.The emerging field of lipidomics[J].Nature Reviews，2005，4(9)：594-610.

[11] 許國(guó)旺，等.代謝組學(xué)——方法與應(yīng)用[M].北京：科學(xué)出版社，2008:161-162.

[12] 蔡潭溪，劉平生，楊福全，等.脂質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2010，37(2)：121-128.

[13] Nakanishi H，Ogiso H，Taguchi R.Qualitative and quantitative analyses of phospholipids by LC-MS for lipidomics[J].Methods in Molecular Biology，2009，579(2)：287-313.

[14] Ivanova P T，Milne S B，Byrne M O，et al.Glycerophospholipid identification and quantitation by electrospray ionization mass spectrometry[J].Methods in Enzymology，2007,432:21-57.

[15] Hermansson M，Hokynar K，Somerharju P.Mechanisms of glycerophospholipid homeostasis in mammalian cells[J].Progress in Lipid Research，2011，50(3)：240-257.

[16] Andreyev A Y，F(xiàn)ahy E，Guan Z.Subcellular organelle lipidomics in TLR-4-activated macrophages[J].Journal of Lipid Research，2010，51(9):2785-2797.

[17] Raetz C R H，Whitfield C.Lipolysaccharide endotoxins[J].Annu Rev Biochem，2002，71:635-700.

[18] Raetz C R，Garrett T A，Reynolds C M，et al.Kdo2-Lipid A ofEscherichiacoli，a defined endotoxin that activates macrophages via TLR-4[J].Journal of Lipid Research，2006，47(5):1097-1111.

[19] Dennis E A，Deems R A，Harkewicz R.A mouse macrophage lipidome[J].Journal of Biological Chemistry，2010，285(51):39976-39985.

[20] van Meer G.Cellular lipidomics[J].The EMBO Journal，2005，24(18):3159-3165.

[21] Gupta S，Maurya M R，Stephens D L，et al.An integrated model of eicosanoid metabolism and signaling based on lipidomics flux analysis[J].Biophysical Journal，2009，96(11):4542-4551.

[22] Buczynski M W，Stephens D L，Bowers-Gentry R C，et al.TLR-4 and sustained calcium agonists synergistically produce eicosanoids independent of protein synthesis in RAW264.7 cells[J].J Biol Chem，2007，282(31)：22834-22847.

[23] Rouzer C A，Ivanova P T，Byrne M O，et al.Lipid profiling reveals arachidonate deficiency in RAW264.7 cells:Structural and functional implications[J].Biochemistry，2006，45(49)：14795-14808.

[24] Rouzer C A，Ivanova P T，Byrne M O，et al.Lipid profiling reveals glycerophospholipid remodeling in zymosan-stimulated macrophages[J].Biochemistry，2007，46(20):6026-6042.

[25] 馮旭，羅俊生，關(guān)寧，等.人膽固醇酯水解酶在RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)對(duì)膽固醇代謝的影響[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，35(11)：1609-1613.

[26] Zhou S H，Yang X H，Wu S J，et al.Paraoxon down regulates ATP-binding cassette transporter A1 expression and decreases cholesterol efflux through cyclic AMP signaling pathway in RAW264.7 macrophage-derived foam cells[J].Progress in Biochemistry and Biophysics，2010,37(2):190-199.

[27] 陶建，李曉輝，劉雅.整合素β1基因?qū)AW264.7細(xì)胞攝脂功能的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33(2):128-131.

[28] Ivanova P T，Milne S B，F(xiàn)orrester J S，et al.Lipid arrays:New tools in the understanding of membrane dynamics and lipid signaling[J].Molecular Interventions，2004，4(2)：86-96.

[29] Zhang F，Zhao G，Dong Z.Phosphatidylcholine-specific phospholipase C and D in stimulation of RAW264.7 mouse macrophage-like cells by lipopolysaccharide[J].International Immunopharmacology，2001，1(7):1375-1384.