間接競爭ELISA法檢測飼料中鹽酸克倫特羅的探討

劉立波

（河北唐縣農(nóng)業(yè)局，河北 唐縣 072350）

鹽酸克倫特羅（CLB）又稱鹽酸雙氯醇氨、氨哮素、克喘素，化學(xué)名稱為α－（[叔丁氨基）甲基]－4－氨基－3，5－二氯苯甲醇鹽酸鹽[1]。CLB主要用于治療人和家畜的支氣管哮喘，但其對(duì)人體有很強(qiáng)的副作用，其半衰期長，在體內(nèi)代謝慢，極易積蓄在肝臟、腎臟等器官中。中毒表現(xiàn)主要為肌肉震顫、頭疼、心悸等。同時(shí)CLB具有蛋白質(zhì)同化作用，在動(dòng)物體內(nèi)代謝過程中促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)的合成，對(duì)脂肪的合成有一定的抑制作用，可以減少脂肪的形成，提高瘦肉率[2]。因此，一段時(shí)間以來CLB被作為一種促生長添加劑而倍受重視。

不法飼料生產(chǎn)商和養(yǎng)殖戶將CLB加入到飼料或飲用水中，用以促進(jìn)生豬、牛、羊的生長，提高瘦肉率。通過飼喂會(huì)使其殘留在動(dòng)物的內(nèi)臟及肌肉組織中，人類食用殘留CLB的動(dòng)物產(chǎn)品發(fā)生中毒，通常表現(xiàn)為面色潮紅、頭痛、胸悶、心悸、心慌、骨骼肌震顫、四肢麻木等一系列不良反應(yīng)。對(duì)心律失常、高血壓、青光眼、糖尿病、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、前列腺肥大等疾病的患者有較大的危害甚至危及生命[3]。故當(dāng)前我國立法禁止將鹽酸克倫特羅作為飼料藥物添加劑使用。加強(qiáng)對(duì)飼料產(chǎn)品中CLB的監(jiān)測，可以保障食品安全，從而保護(hù)人的建康與安全。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇飼料樣本16份作為試驗(yàn)材料，其中8份來自經(jīng)過河北省飼料檢測中心檢測的不含鹽酸克倫特羅的樣本，另外8份來自于銷售市場的隨機(jī)抽樣。

1.2 主要儀器和試劑

酶標(biāo)儀；微量移液器（20、50、100μL）；96孔酶標(biāo)板1塊（包被有偶聯(lián)抗原）；標(biāo)準(zhǔn)液6瓶：（1 mL/瓶）0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 ppb；高濃度標(biāo)準(zhǔn)品：100 ppb 1mL；酶標(biāo)二抗7mL；克倫特羅抗體工作液7mL；底物液A液、B液（TMB底物溶液）各7mL；終止液7mL；20×濃縮洗滌液40mL。

1.3 檢測原理

鹽酸克倫特羅間接競爭ELISA檢測試劑盒基于間接競爭性酶聯(lián)反應(yīng)原理，在酶標(biāo)板微孔板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中殘留的CLB和微孔板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗CLB抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用底物顯色，樣本吸光度值與其所含殘留物鹽酸克侖特羅的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣品中CLB的含量[4]。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品中鹽酸克倫特羅的提取

將飼料樣本用研缽研碎，用電子天平稱取粉碎的樣本2.0 g，然后將此樣本加入50mL離心管中，加入2mol·L－1的鹽酸溶液中，加入蒸餾水16mL，用力反復(fù)搖晃，然后放置超聲波水浴中超聲30 min。用3 000 rpm離心20min，取出上清液加入氫氧化鈉溶液2mL（1mol·L－1）混合均勻，將pH調(diào)至6.5～7.5，3 000 rpm離心20min，取100μL上清液和900μL蒸餾水混合，取用20μL備用。

1.4.2 樣品中鹽酸克倫特羅的測定

依據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY－T1460－2007《飼料中鹽酸克倫特羅的測定酶聯(lián)免疫吸附法》方法測定[5]。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

將6個(gè)濃度的鹽酸克倫特羅的標(biāo)準(zhǔn)溶液（0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 ppb）和待測溶液按限量法測定步驟測定相應(yīng)的吸光度值。百分吸光率的計(jì)算法見式（1）。

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0 ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

以百分吸光率為縱坐標(biāo)，以克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料樣品中鹽酸克侖特羅的測定結(jié)果

飼料樣品中鹽酸克侖特羅的測定結(jié)果見表1。

表1 飼料樣本檢測結(jié)果

依據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY－T438－2001《飼料中鹽酸克倫特羅的測定》，中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY－T1460－2007《飼料中鹽酸克倫特羅的測定酶聯(lián)免疫吸附法》，中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T22147－2008《飼料中沙丁胺醇，萊克多巴胺，鹽酸克倫特羅的測定液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法》中規(guī)定CLB檢測限為0.01mg·kg－1，CLB定量限為0.05mg·kg－1，飼料在處理過程中被稀釋100倍，表1中檢測樣1～6是測定飼料中添加CLB用以測定回收率，樣本7～17是抽檢的飼料樣本，可以看出，目前市場上的飼料產(chǎn)品中沒有添加違禁藥物CLB，飼料的質(zhì)量安全可靠[5－6]。

2.2 樣品陽性添加物回收率

在經(jīng)本方法測定過的不同飼料樣本中準(zhǔn)確加入一定量的鹽酸克倫特羅，按同樣的操作過程提取、測定，計(jì)算回收率。平均回收率為96.9%。陽性添加物回收率結(jié)果見表2。

表2 陽性添加物回收率

通過表2可以看出，陽性添加回收率平均達(dá)到96.9%，符合試劑盒中所規(guī)定的85%～95%的回收率數(shù)值，表明此次檢測準(zhǔn)確可靠。賈濤研究表明，酶聯(lián)免疫方法具有操作簡便、靈敏度高、成本低的優(yōu)點(diǎn)，鹽酸克倫特羅酶朕免疫反應(yīng)測試盒為養(yǎng)殖者和政府監(jiān)督管理部門提供了更準(zhǔn)確快速檢測克倫特羅殘留的方法，該試劑盒的提取方法能達(dá)到75%～95%的回收率，可以不需用有機(jī)溶劑并在10～30min完成提取過程。該法具有靈敏度高（0.05 ng·g－1）、檢測下限低（肉類/脂肪 0.025 ng·g－1、尿液 0.05 ng·mL－1、飼料0.2 μg·kg－1）、檢測時(shí)間≤2 h；重復(fù)性高的特點(diǎn)[7]。

3 結(jié)論

間接競爭ELISA法可以直接用于測定飼料中鹽酸克倫特羅含量，具有良好的靈敏度和穩(wěn)定性。

[1]陳啟佳.鹽酸克倫特羅在肉制品中的危害及其檢測方法研究進(jìn)展[J].肉類研究,2011（6）:58－60.

[2]王?；?黃素珍.鹽酸克倫特羅的危害性與檢測[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2003（4）:41－43.

[3]翟福麗,賴克強(qiáng),張衍亮,等.動(dòng)物性食品中β-興奮劑殘留概述[J].食品科學(xué),2011（5）:351－356.

[4]Jiang JQ,Zhang H T,Wang Z L.Preparation and Identification ofanti－RactopamineMonoclonalantibodies[J].IPCBEE,2011（3）:78－81.

[5]中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn).NY－T1460－2007飼料中鹽酸克倫特羅的測定.酶聯(lián)免疫吸附法[S].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2008.

[6]中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn).GB/T22147－2008飼料中沙丁胺醇,萊克多巴胺,鹽酸克倫特羅的測定.液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008.

[7]賈濤.酶聯(lián)免疫法檢測鹽酸克倫特羅的試驗(yàn)報(bào)告[J].北京農(nóng)業(yè),2007,33:47－54.