有氧運動和白藜蘆醇對肥胖大鼠脂聯(lián)素受體及下游信號通路的影響

摘要：為了探討有氧運動和白藜蘆醇對肥胖大鼠脂聯(lián)素受體及下游信號通路的影響及機(jī)制，將40只大鼠分成5組，分別為普通對照組（C）、肥胖模型對照組（D）、肥胖運動組（E）、白藜蘆醇對照組（F）、白藜蘆醇運動組（G）；造模完成后，E和G組采用6周跑臺訓(xùn)練，F(xiàn)和G組按照大鼠稱重后40 mg/kg的白藜蘆醇（Res）劑量進(jìn)行6周灌胃。用ELISA法測得血清脂聯(lián)素；RT-PCR方法測得AdipoR1、AdipoR2及PPARγ、AMPKα蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）血清脂聯(lián)素水平模型組低于普通對照組，而模型組中白藜蘆醇運動組最高；（2）脂聯(lián)素受體1和2的蛋白表達(dá)，白藜蘆醇運動組均高于其它各模型組；（3）普通對照組PPARγmRNA表達(dá)最高，而AMPKαmRNA表達(dá)白藜蘆醇運動組最高；以上結(jié)果說明，本實驗中通過運動和白藜蘆醇聯(lián)合干預(yù)，提高血清脂聯(lián)素及受體的水平，從而降低TG、GLU等相關(guān)指標(biāo)，脂聯(lián)素受體激活下游信號通路蛋白AMPKαmRNA和PPARγmRNA，并使其表達(dá)增加，從而在一定程度上改善大鼠內(nèi)臟脂肪細(xì)胞的紊亂，減少脂肪合成，增加血清TG清除，減少脂肪組織脂肪積聚，對改善大鼠肥胖起到了一定的作用。

關(guān)鍵詞：運動生物化學(xué)；脂朕素受體；有氧運動；白藜蘆醇；血清脂聯(lián)素；大鼠

中圖分類號：G804.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-7116（2012）06-0139-06

肥胖癥與高血壓、高血脂、高血糖等心腦血管疾病密切相關(guān)，研究肥胖的發(fā)生及控制的理論與方法是目前亟待解決的問題。發(fā)生肥胖的原因眾多，其中，高脂飲食和不正確的生活方式，是引起肥胖發(fā)生最主要的因素[1]。

脂聯(lián)素作為近年來發(fā)現(xiàn)的一種由脂肪細(xì)胞分泌的特異性蛋白，可通過與靶細(xì)胞膜上的脂聯(lián)素受體結(jié)合，激活下游信號通路，促進(jìn)脂肪酸氧化和葡萄糖攝取，參與葡萄糖、脂肪代謝調(diào)節(jié)。近年來研究顯示，運動和白藜蘆醇單獨干預(yù)均可提高脂聯(lián)素及受體水平[2-3]，但通過雙重干預(yù)的作用，對脂聯(lián)素受體下游信號通路的研究尚未見到報道。本研究試圖通過二者聯(lián)合干預(yù)的共同作用，觀察脂聯(lián)素及受體下游信號通路蛋白表達(dá)的變化，探討有氧運動和白藜蘆醇聯(lián)合干預(yù)的疊加作用，為更有效改善肥胖癥提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物與動物分組

雄性SD大鼠40只（（190±5.0） g，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)），適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后（環(huán)境溫度20～25℃），隨機(jī)分為5組每組8只：普通對照組（C）、肥胖模型對照組（D）、肥胖運動組（E）、白藜蘆醇對照組（F）、白藜蘆醇運動組（G）。普通對照組采用普通飼料喂養(yǎng)，其它各模型組均為高脂飼料喂養(yǎng)，自由飲食飲水。高脂飼料比例（質(zhì)量比）：碳水化合物（60%）、蛋白質(zhì)（20%）、脂肪（5%）。高脂喂養(yǎng)26周。分組時組間體重?zé)o顯著性差異。

1.2 動物運動及灌胃方式

訓(xùn)練模型：Bedford等根據(jù)大鼠體重/攝氧量回歸方程所建立的遞增運動負(fù)荷訓(xùn)練大鼠模型[4]。正式訓(xùn)練前，大鼠進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練1周。正式訓(xùn)練開始，速度為運動強(qiáng)度65% VO2max，20～25 m/min；每天訓(xùn)練1 h，09：00～10：00訓(xùn)練，每周訓(xùn)練5 d。共6周。

給藥時間和劑量：模型建立成功后，F(xiàn)組和G組每天08：00給藥，每周7 d。大鼠稱重后按照40 mg/kg劑量的白藜蘆醇（Res）溶于1 mL的雙蒸水中，形成混溶液后進(jìn)行灌胃[5]。

1.3 動物組織取材

訓(xùn)練、灌藥結(jié)束后取材，各組大鼠采用水合氯醛麻醉，取腹部正中線切口，迅速腹主動脈取血6～8 mL，采血后，快速取出腹部脂肪組織稱量并記錄，做好標(biāo)記，立即將脂肪標(biāo)本置于液氮中，然后放于-80 ℃的冰箱中保存。

1.4 血液指標(biāo)的測定

將3 mL血置于EDTA抗凝管中，以4 000 r/min離心5 min分離血清，取2 mL置于EDTA抗凝管中。血脂、血糖、HDL（好膽固醇）、LDL（壞膽固醇）檢測均采用暨南大學(xué)華僑醫(yī)院全自動生化分析儀（HITACH公司7020全自動生化分析儀）進(jìn)行測定。

血清脂聯(lián)素的測定采用酶聯(lián)免疫吸附法，具體步驟按試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）說明進(jìn)行。其原理為雙抗體夾心法，即用初抗包被，標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品中的脂聯(lián)素與其特異性結(jié)合，再加入標(biāo)記的兔抗鼠脂聯(lián)素抗體，它可與SA-HRP特異性結(jié)合。SA-HRP可催化底物顯色，加入中止液，用酶標(biāo)儀讀取每孔的光密度值，樣品中脂聯(lián)素的濃度與其光密度值成正比關(guān)系。

1.5 RT-PCR法測定大鼠脂肪組織基因表達(dá)

用RT-PCR方法測定脂肪組織中AdipoR1、AdipoR2、AMPK、PPARγ的mRNA基因表達(dá)。（引物序列見表1）。

用Trizol試劑，采用一步法提取組織中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄（RT）（按試劑盒說明書），然后進(jìn)入PCR反應(yīng)，PCR過程：30 μL PCR反應(yīng)體系：15×PCR buffer 2 μL，dNTP 0.5 μL、Taq酶0.4 μL、MgCl2 22 μL、ddH 2O 7.3 μL、引物各2 μL。PCR循環(huán)反應(yīng)條件：AdipoR1和R2 94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)；AMPKα、PPARγ 97 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共50循環(huán)。結(jié)果用SMART VIEW ANALYSIS PROGRAM凝膠成像分析軟件系統(tǒng)進(jìn)行處理分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ±s）表示，使用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，選用單因素方差分析，P<0.05表示差異有顯著性，P<0.01表示差異有非常顯著性，同時采用Excel2007進(jìn)行圖形處理。

2 實驗結(jié)果及分析

2.1 高脂模型的指標(biāo)體系

大鼠跑臺訓(xùn)練結(jié)束后，在最后一次訓(xùn)練結(jié)束后5 h內(nèi)測定大鼠血清甘油三酯（TG）、血糖（GLU）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）。結(jié)果見表2。

從表1可以看到，D組的TG、GLU、LDL值都顯著高于其他各組（P<0.01），G組TG低于其它各模型組，G組HDL高于其它各模型組，F(xiàn)組高于E組但無差異性，G組LDL低于D組且差異存在非常顯著性（P<0.01）。

2.2 六周訓(xùn)練期間大鼠體重變化

從圖1中可見，肥胖大鼠模型建立成功后，進(jìn)行6周訓(xùn)練和白藜蘆醇干預(yù)，D組大鼠體重一直處于增長的態(tài)勢且高于其它各組，差異具有非常顯著性（P<0.01）；E組和G組開始運動的1周體重出現(xiàn)了下降的拐點，到第2周恢復(fù)上升趨勢，直到6周末增長速度都較為緩慢，其中G組更為緩慢。

從圖2A中看到，C組血清脂聯(lián)素質(zhì)量濃度最高，F(xiàn)組低于E組，D組顯著低于其它各組（P<0.01）；圖2 B中C組的AdipoR1mRNA表達(dá)低于G組，差異存在顯著性（P<0.05），AdipoR2mRNA表達(dá)C組最高，D組AdipoR1mRNA和AdipoR2mRNA表達(dá)低于C組，差異存在非常顯著性（P<0.01）。G組AdipoR1mRNA和AdipoR2mRNA表達(dá)均高于其它各模型組。

2.4 各組大鼠脂肪組織PPARγmRNA表達(dá)的變化

圖3中顯示，D組PPARγmRNA低于其它各組，且差異有非常顯著性（P<0.01），模型組均低于普通安靜組，差異存在顯著性（P<0.05），G組高于其它模型組，但差異無顯著性。

2.5 各組大鼠脂肪組織AMPKαmRNA表達(dá)

從圖4中可以看出：D組低于其它各組且差異存在非常顯著性（P<0.01），G組高于其它各模型組，且差異存在非常顯著性（P<0.01）。

目前在研究肥胖的發(fā)病機(jī)制及治療方案中，建立可靠的動物模型是非常關(guān)鍵的。鑒于高脂飲食是誘導(dǎo)肥胖發(fā)生最主要的因素，同時高脂飲食作為營養(yǎng)性肥胖造模最常用的方法，本實驗通過20周的高脂飲食喂養(yǎng)，成功建立了營養(yǎng)性肥胖大鼠模型。為下一步實驗工作提供了研究基礎(chǔ)和平臺。肥胖模型建立成功后，經(jīng)過6周的跑臺訓(xùn)練和白藜蘆醇聯(lián)合干預(yù)后，白藜蘆醇運動組大鼠的TG、GLU、LDL明顯降低，HDL增加，體重增加較肥胖模型組緩慢，表明有氧運動及白藜蘆醇聯(lián)合干預(yù)對減輕肥胖有一定效果，也印證了適宜運動和白藜蘆醇可以改善肥胖的癥狀。

3.2 運動和白藜蘆醇對脂聯(lián)素及其受體的影響

脂聯(lián)素是脂肪組織特異性分泌的一種脂肪細(xì)胞因子，它能夠影響機(jī)體處理糖類和脂肪的能力。脂聯(lián)素除了直接作用于外周組織，也通過作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)來提高糖脂代謝，從而減輕體重，減少脂肪含量。脂聯(lián)素作用的機(jī)制與其兩個受體有關(guān)，即AdipoR1、AdipoR2[6]。脂聯(lián)素受體在脂肪代謝、分化過程中具有重要作用。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肥胖模型組血清脂聯(lián)素及其受體明顯低于普通對照組，表明肥胖大鼠脂聯(lián)素水平降低；脂聯(lián)素水平與脂肪量成反比，脂聯(lián)素降低是體脂增加的一個反饋抑制，這可能是肥胖進(jìn)一步發(fā)展的因素之一。大量的研究表明通過運動可以提高脂聯(lián)素及其受體水平[7-9]，本研究結(jié)果與前人研究一致，肥胖運動組血清脂聯(lián)素及其受體表達(dá)提高，說明通過運動干預(yù)可上調(diào)脂聯(lián)素水平，從而降低體脂，加速脂代謝水平，一定程度上改善機(jī)體肥胖。

白藜蘆醇主要來源于葡萄、虎杖等植物，具有降血脂[10]、抗氧化[11]等作用。白藜蘆醇可調(diào)節(jié)載脂蛋白，作為配體與相應(yīng)受體結(jié)合，參與脂蛋白的代謝，促使體內(nèi)脂代謝趨于正常，從而調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)與脂蛋白代謝紊亂，Leonor River a 等人檢測到經(jīng)白藜蘆醇預(yù)處理后，肥胖Zuker大鼠內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素的含量明顯增加，提示白藜蘆醇對脂聯(lián)素合成具有上調(diào)的作用[12]。本實驗中單純白藜蘆醇干預(yù)組，脂聯(lián)素水平及其受體表達(dá)均高于肥胖模型組，這可能是因為白藜蘆醇激活了Sirt1，限制了機(jī)體攝入過多熱量；Sirt1能通過激活轉(zhuǎn)錄因子（Foxo1）并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子（Foxo1）與C/EBP的相互作用，增加血清脂聯(lián)素及其受體的表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn)通過有氧運動和白藜蘆醇單獨干預(yù)，均可提高肥胖大鼠脂聯(lián)素及其受體的表達(dá)；本研究的重點在于觀察二者的共同干預(yù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇運動組脂聯(lián)素及受體表達(dá)高于有氧運動組或白藜蘆醇單獨干預(yù)組，提示二者共同干預(yù)對脂聯(lián)素及受體的表達(dá)具有疊加效應(yīng)，這可能是在雙重刺激下，脂聯(lián)素受體下游信號通路蛋白增加，結(jié)合脂聯(lián)素基因啟動子上PPRE，增強(qiáng)脂聯(lián)素基因啟動子的活性，影響脂聯(lián)素的表達(dá)和分泌。

3.3 運動和白藜蘆醇對脂聯(lián)素下游信號通路的影響

脂聯(lián)素在靶細(xì)胞膜上與脂聯(lián)素受體結(jié)合，可激活下游信號通路蛋白AMPK、PPAR等，從而參與對葡萄糖、脂肪代謝過程的調(diào)節(jié)。脂聯(lián)素通過與受體結(jié)合刺激PPAR，使其活性提高，從而增加葡萄糖的攝取和脂肪酸氧化[13]。Tsuchida等[14]用脂聯(lián)素作用C2C12細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)PPAR配體活性提高，刺激了脂肪酸氧化，說明PPAR可能是脂聯(lián)素傳導(dǎo)信號通路中的一個重要信號分子。最新研究顯示8周的運動訓(xùn)練能夠上調(diào)骨骼肌中PPARγ表達(dá)，從而提高抗炎作用，有效抑制膽固醇的運輸[15]。Yamauchi等[6]用脂聯(lián)素作用C2C12肌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)AMPK及Acc的磷酸化增加，當(dāng)C2C12肌細(xì)胞AdipoR1表達(dá)提高后，上述效應(yīng)更為明顯，說明脂聯(lián)素通過與受體結(jié)合，活化AMPK進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)作用。長期運動可對AMPK活性反復(fù)刺激，在運動適應(yīng)過程中提高骨骼肌安靜狀態(tài)AMPK的活性[16-18]。

本實驗中通過6周運動發(fā)現(xiàn)，肥胖運動組較肥胖模型對照組PPARγ和AMPKα蛋白表達(dá)升高。有氧運動時機(jī)體動員脂肪供能占優(yōu)勢，釋放FFA進(jìn)入血液，氧化供能。另外，也動員和氧化脂肪組織內(nèi)甘油三酯，使血液和細(xì)胞內(nèi)FFA處于活躍的產(chǎn)生、利用的動態(tài)過程之中。許多脂肪酸是PPARγ的天然配體，因此推斷運動通過對內(nèi)源性配體的影響，激活PPARγ表達(dá)。同時運動上調(diào)脂聯(lián)素受體與PPARγ和AMPKα結(jié)合刺激脂肪酸氧化，增加血清TG清除，減少脂肪組織脂肪積聚。

研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇是PPARγ的激活劑[19]。小鼠實驗證明，白藜蘆醇能夠改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖、胰島素抵抗[20]。李曉寒等研究發(fā)現(xiàn)高脂條件下，白藜蘆醇能激活PPARγmRNA的表達(dá)從而抑制脂代謝紊亂。Jing Shang等發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能促進(jìn)AMPK磷酸化，從而表現(xiàn)出改善胰島素抵抗的作用[21]。通過白藜蘆醇改善高脂誘導(dǎo)的IR大鼠的研究，發(fā)現(xiàn)此過程與激活A(yù)MPK有關(guān)[22]。本研究中白藜蘆醇組較肥胖模型對照組 PPARγ和AMPKα蛋白表達(dá)升高，這與脂聯(lián)素及其受體升高進(jìn)而激活下游通路AMPKα蛋白的表達(dá)有關(guān)，其機(jī)制可能是白藜蘆醇通過激活SIRT1和PGC-1途徑完成。白蘆藜醇激活下游信號通路蛋白，在一定程度上提高糖代謝的水平同時減少脂質(zhì)沉積。

本研究首次探討運動訓(xùn)練和白藜蘆醇共同干預(yù)對脂聯(lián)素受體下游信號通路蛋白表達(dá)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，6周跑臺訓(xùn)練或白藜蘆醇單獨干預(yù)均能提高脂聯(lián)素受體下游通路蛋白的表達(dá)，這對于改善大鼠肥胖具有重要意義。那么二者共同干預(yù)能否起到疊加效應(yīng)呢？結(jié)果顯示二者共同干預(yù)能夠提高肥胖大鼠脂肪組織中脂聯(lián)素受體下游蛋白表達(dá)，其中PPARγ蛋白表達(dá)量高于其它各模型組，但無顯著性差異；而AMPKα蛋白表達(dá)顯著高于其它各模型組。二者呈現(xiàn)出疊加效應(yīng)。二者共同干預(yù)增加了PPARγ和AMPKα蛋白的表達(dá)，表明運動訓(xùn)練和白藜蘆醇共同干預(yù)比單一因素干預(yù)，更有有效的激活了肥胖大鼠脂聯(lián)素受體下游信號通路，使通路蛋白表達(dá)增加。

本研究通過運動和白藜蘆醇聯(lián)合干預(yù)動物試驗，使脂聯(lián)素及其受體水平升高，同時增加了下游信號通路中PPARγ和AMPKα蛋白表達(dá)。脂聯(lián)素受體和下游蛋白相結(jié)合刺激脂肪酸氧化，在一定程度上改善大鼠內(nèi)臟脂肪細(xì)胞的紊亂，減少脂肪合成，增加血清TG清除，減少脂肪組織脂肪積聚。因此，本研究認(rèn)為有氧運動和白藜蘆醇聯(lián)合干預(yù)可能是一種改善肥胖癥的理想方法。

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