黃瓜品種抗疫病鑒定及其防御相關(guān)酶系研究

柴喜榮，林 潔，楊 暹，康云艷

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642）

疫病是危害黃瓜生產(chǎn)的毀滅性土傳病害，由疫霉菌侵染引起，苗期至成株期均可發(fā)病，潛育期短，傳播速度快，侵染力強，廣東省每年春植或夏、秋植黃瓜由疫病引起的死株率輕則10%，重則高達80%［1-2］。由于疫霉菌抗性來源的復(fù)雜性和疫霉菌發(fā)生遺傳變異的速度非?？?，瓜類疫病抗性育種進展緩慢。目前，黃瓜品種中尚未發(fā)現(xiàn)對該病具有完全免疫或高抗的類型。一些農(nóng)業(yè)措施如輪作、嫁接、清潔田園等，均有一定的減輕病害的效果，但均不能從根本上控制病害［3］。植物誘導(dǎo)抗病性產(chǎn)生常常伴隨著病程相關(guān)蛋白（Pathogenesis related protein，PRs）的大量積累。在這些PRs中，幾丁質(zhì)酶（Chitinase，CHT）和葡聚糖酶（Glucanase，GLU）具有直接殺傷或抵抗病原物的活性與作用［4-5］；過氧化物酶（Peroxidase，POD）則參與細胞木質(zhì)化過程，使細胞壁加強、抗病性增加；苯丙氨酸解氨酶（Phenylalnine ammonialyase，PAL）是植物保衛(wèi)素、木質(zhì)素和酚類化合物合成的關(guān)鍵酶和限速酶；多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）可以在植物受病原菌侵染時氧化酚生成醌，對病菌產(chǎn)生抑制和毒害作用［6］。

本試驗通過灌根接種約5×103個/mL甜瓜疫霉菌游動孢子懸浮液，對不同來源的7個黃瓜品種進行抗病性篩選，并以篩選出的中農(nóng)20號和正源油綠花青大吊瓜分別為感/抗品種，進一步探討疫霉菌對黃瓜葉片內(nèi)病程相關(guān)蛋白POD、PPO、PAL、GLU、CHT活性的影響，研究結(jié)果可為揭示黃瓜疫霉菌抗性生理機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試黃瓜品種：中農(nóng)20號由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供，正源油綠花青大吊瓜由汕頭市利農(nóng)蔬菜良種研究所提供，長春密刺由哈爾濱金龍農(nóng)業(yè)有限公司提供，津優(yōu)1號由天津市黃瓜研究所提供，抗病二號、粵秀3號和早青二號由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供。

供試菌種：甜瓜疫霉菌（Phytophthora melonis）由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院提供。將病原菌接種在胡蘿卜培養(yǎng)基上，置于26℃的人工氣候箱黑暗培養(yǎng)，7 d后加入適量土壤浸出液，26℃、全光照誘導(dǎo)游動孢子1～2 d，經(jīng)血球計數(shù)板計數(shù)，配成終濃度約為5×103個/mL的游動孢子懸浮液。

胡蘿卜培養(yǎng)基：胡蘿卜200 g切片榨汁，加入蒸餾水浸泡5 min后過濾、定容至1 L，搖勻，然后按100 mL分裝，每瓶加入1.3 g瓊脂糖，121℃高壓蒸汽滅菌備用。

土壤浸出液：肥沃菜園土50 g，蒸餾水200 mL，攪拌，過濾，所得濾液即土壤浸出液。

1.2 試驗方法

試驗在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜試驗基地進行。2013年7月1日，將7個黃瓜品種種子浸種催芽，發(fā)芽后播于裝有草炭∶珍珠巖∶蛭石=1∶1∶1混合基質(zhì)的32孔育苗盤中，基質(zhì)經(jīng)134℃高溫蒸汽滅菌1 h，常規(guī)管理。7月14日黃瓜幼苗兩葉一心期，灌根接種約5×103個/mL疫霉菌游動孢子懸浮液，以清水作對照。接種前澆透水，取10 mL游動孢子懸浮液加至距植株莖基部2～3 cm處的基質(zhì)內(nèi)，接種后將植株置于鑒定室內(nèi)保濕（RH為100%）24 h，以后保持土壤濕度近飽和，接種期間溫度控制在24～28℃。接種后2 d統(tǒng)計病情指數(shù)，并取各處理植株的第2片真葉，用于PPO、POD、PAL、CHT、GLU活性的測定。每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)32株。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 黃瓜疫病抗性鑒定 根據(jù)NY/T 1857-2010 《黃瓜主要病害抗病性鑒定技術(shù)規(guī)程》稍作修改，游動孢子懸浮液接種量由2 mL/株改為10 mL/株，病情調(diào)查時間由接種后7 d 改為接種后3 d，計算病情指數(shù)，并評價黃瓜品種的抗病性。

（1）病情分級。室內(nèi)病情分級及其癥狀描述見表1。

表1 黃瓜疫病病情分級標(biāo)準(zhǔn)

（2）病情指數(shù)。病情指數(shù)計算公式為：

式中，DI為病情指數(shù)，s為各病情級別代表數(shù)值，n為各病情級別病株數(shù)，N為調(diào)查總株數(shù)，S為最高病情級別代表值。

（3）抗性評價標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)發(fā)病材料的病情指數(shù)，確定其對疫病的抗性水平，劃分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 黃瓜對疫病抗性評價標(biāo)準(zhǔn)

1.3.2 酶活性測定 POD、PAL、PPO活性測定參照Chen等［7］的方法，CHT、GLU活性測定參照Ge等［8］的方法。

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS Statistics 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同黃瓜品種抗病性鑒定

如圖1所示，本試驗7個黃瓜品種接種5×103個/mL甜瓜疫霉菌游動孢子后，各品種對疫霉菌的抗性表現(xiàn)不同，由強到弱依次為花青大吊瓜＞長春密刺＞粵秀3號＞抗病2號＞津優(yōu)1號＞中農(nóng)20號＞早青2號。其中，長春密刺、正源油綠花青大吊瓜、抗病二號和粵秀3號 等4個品種病情指數(shù)范圍均表現(xiàn)出中抗，品種間抗性無顯著差異；中農(nóng)20號、早青二號和津優(yōu)1號3個品種病情指數(shù)范圍均表現(xiàn)出感病，品種間抗性亦無顯著差異。本試驗選定中抗品種花青大吊瓜、感病品種中農(nóng)20號進一步探討葉片中病程相關(guān)蛋白的變化規(guī)律。

圖1 不同黃瓜品種接種甜瓜疫霉菌后的病情指數(shù)

2.2 接種疫霉菌對不同抗性黃瓜品種葉片POD活性的影響

從圖2可以看出，未接種疫霉菌條件下，中抗品種葉片POD活性顯著高于感病品種；接種疫霉菌顯著誘導(dǎo)提高了抗感品種葉片POD活性，與對照相比，感病品種中農(nóng)20號POD活性提高150%，中抗品種花青大吊瓜提高91%，但中抗品種的POD活性仍然高于感病品種。

圖2 接種疫霉菌對黃瓜葉片POD活性的影響

2.3 接種疫霉菌對不同抗性黃瓜品種PPO活性的影響

從圖3可以看出，未接種疫霉菌條件下，中抗品種葉片PPO 活性顯著高于感病品種；接種疫霉菌顯著誘導(dǎo)提高了感病品種中農(nóng)20號葉片PPO活性，與對照相比，葉片PPO活性提高211%，而對中抗品種花青大吊瓜葉片PPO活性無顯著誘導(dǎo)作用。接種病原菌后，感病品種中農(nóng)20號葉片PPO活性顯著高于中抗品種花青大吊瓜。

圖3 接種疫霉菌對黃瓜葉片PPO活性的影響

2.4 接種疫霉菌對不同抗性黃瓜品種PAL活性的影響

由圖4可知，未接種疫霉菌條件下，中抗品種葉片PAL活性顯著高于感病品種；接種疫霉菌顯著誘導(dǎo)提高抗感品種葉片PAL活性，與對照相比，感病品種中農(nóng)20號PAL活性提高321%，中抗品種花青大吊瓜提高93%，但中抗品種的PAL活性仍然高于感病品種。

圖4 接種疫霉菌對黃瓜葉片PAL活性的影響

2.5 接種疫霉菌對不同抗性黃瓜品種CHT活性的影響

從圖5可以看出，未接種疫霉菌條件下，感病品種中農(nóng)20號葉片CHT活性顯著高于中抗品種花青大吊瓜；接種疫霉菌對抗/感品種葉片CHT活性均無顯著影響。

圖5 接種疫霉菌對黃瓜葉片CHT活性的影響

2.6 接種疫霉菌對不同抗性黃瓜品種GLU活性的影響

從圖6可以看出，未接種疫霉菌條件下，中抗品種葉片GLU 活性顯著高于感病品種；接種疫霉菌顯著誘導(dǎo)提高感病品種中農(nóng)20號葉片GLU活性，與對照相比，葉片GLU活性提高144%，而接種疫霉菌對中抗品種花青大吊瓜葉片GLU活性無顯著誘導(dǎo)作用。接種病原菌后，感病品種中農(nóng)20號葉片GLU活性顯著高于中抗品種花青大吊瓜。

圖6 接種疫霉菌對黃瓜葉片GLU活性的影響

3 結(jié)論與討論

本試驗以7個不同黃瓜品種進行疫病的抗病性篩選，其中長春密刺、正源油綠花青大吊瓜、抗病二號和粵秀3號4個品種抗性較強，為中抗品種；中農(nóng)20號、早青二號和津優(yōu)1號3個品種抗性較弱，為感病品種，沒有發(fā)現(xiàn)高抗或免疫品種。進一步的試驗以中農(nóng)20號和花青大吊瓜分別為感/抗材料，用于測定防御相關(guān)酶活性，結(jié)果表明，未接種疫霉菌條件下，正源油綠花青大吊瓜黃瓜葉片的POD、PPO、PAL、GLU活性均顯著高于感病品種中農(nóng)20號。接種疫霉菌游動孢子懸浮液后，中抗品種花青大吊瓜葉片的POD、PAL活性顯著升高，其余相關(guān)酶活性無顯著變化；感病品種中農(nóng)20號葉片POD、PPO、PAL、GLU活性顯著增強，且增幅均大于中抗品種花青大吊瓜；接種前后兩個品種的CHT活性均無明顯變化。由此可以推測，未接種疫霉菌條件下，中抗品種植株葉片內(nèi)含有更高的防御相關(guān)酶活性，病原菌侵染后，植株能迅速提高POD、PAL活性，增強細胞壁，來抵御病原菌的侵染；相反，未接種疫霉菌條件下，感病品種中農(nóng)20號葉片內(nèi)防御相關(guān)酶活性水平低，植株被疫霉菌侵染后，葉片內(nèi)除了POD、PPO、PAL細胞壁相關(guān)酶活性上升外，GLU活性也迅速升高，原因可能是病菌侵染細胞后，感病黃瓜品種的膜系統(tǒng)受損、透性增加，酶與底物無控制地接觸，從而表現(xiàn)為酶促反應(yīng)加速、酶活性提高，GLU的合成與積累顯著被誘導(dǎo)，參與了植株對病原菌的防御；接種前后感/抗品種CHT活性均無明顯變化，原因可能是甜瓜疫霉菌細胞壁中沒有幾丁質(zhì)，因此幾丁質(zhì)酶活性沒有受誘導(dǎo)。

POD、PPO、PAL是植物次生代謝過程中的3個關(guān)鍵酶，不僅是重要的內(nèi)源活性氧清除劑，而且主要負責(zé)催化細胞壁中的大分子物質(zhì)交聯(lián)以加強細胞壁的結(jié)構(gòu)或修復(fù)受損的細胞壁，屬于植物防衛(wèi)系統(tǒng)相關(guān)酶，因此可作為植物抗病的生化指標(biāo)［9-11］。在植物抗病防御系統(tǒng)中，CHT和GLU的作用也受到普遍關(guān)注，如CHT和GLU能直接攻擊病原物，特別是病原真菌；GLU和CHT可以直接酶解病原真菌的細胞壁使致病病原物瓦解，失去致病能力；酶解后病原物的細胞壁破碎物又可以作為激發(fā)子再次刺激植物產(chǎn)生抗病防衛(wèi)反應(yīng)，從而達到抗病的目的［12］。

POD、PPO、PAL、GLU、CHT與植物抗病性的關(guān)系在不同植物、多種病害的研究結(jié)論不甚一致。侯茜等［13］研究表明，POD、PPO、PAL、CHT的活性與抗病性呈正相關(guān)，可用西瓜幼苗根部POD、PPO、PAL、CHT的活性作為反映苗期西瓜材料枯萎病抗性的生理生化指標(biāo)；李新等［14］對黃瓜不同品種苗期感染枯萎病菌后幾種酶活性變化的研究發(fā)現(xiàn)，接種枯萎病菌后，抗/感品種3種酶活性均增高，但抗病品種的酶活性增加幅度高于感病品種；相反，劉守偉等［15］對黃瓜與枯萎病菌的研究指出，不同抗性黃瓜品種接種枯萎病菌后抗/感品種POD、PPO活性都升高，但感病品種上升速度快、幅度大；張少英等［16］對甜菜與叢根病的研究發(fā)現(xiàn)，供試4個甜菜品種的CHT和GLU活性均表現(xiàn)為抗病品種高于感病品種；左豫虎等［17］對大豆與疫霉根腐病的研究指出，大豆對大豆疫霉根腐病的抗性與CHT、GLU活性呈正相關(guān)關(guān)系；Liang等［18］對黃瓜與白粉病的研究指出，接種白粉病菌能夠誘導(dǎo)黃瓜葉片CHT活性升高，且CHT活性與黃瓜抗病性呈正相關(guān)；而莫熙禮等［19］對辣椒與白粉病菌的研究指出，CHT活性與辣椒的抗病性無相關(guān)性，該結(jié)果與許多學(xué)者研究結(jié)果不一致。