抗疏健骨顆粒對去卵巢骨質疏松大鼠血清骨代謝及骨組織自噬水平的影響

王玥 劉啟玲 徐守竹 田敏敏 張蓓 張榮強 孫娜 史傳道

陜西中醫(yī)藥大學公共衛(wèi)生學院，陜西 咸陽 712046

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量、骨基質和骨小梁數(shù)量減少、骨組織微結構破壞而導致的以骨脆性增加為特征的全身代謝障礙性疾病[1]。其發(fā)病率高，病程長，常伴有嚴重并發(fā)癥。據(jù)統(tǒng)計，70 %以上的病理性骨折由OP引起，進而增加死亡率(20 %～24 %)和致殘率(40 %)，嚴重威脅人類健康[2]。目前，我國OP發(fā)病率高達7 %，預計到2050年我國OP和低骨量患者將增至3億[3]。

骨骼處于骨形成與骨吸收的動態(tài)平衡中，當這種平衡被打破時，就可引起骨穩(wěn)態(tài)失衡，最終發(fā)生OP[4]。骨穩(wěn)態(tài)的維持需要成骨細胞(OB)、破骨細胞(OC)和骨細胞等多種細胞、激素、因子的密切配合[5]。絕經(jīng)后，由于雌激素減少引起骨量丟失增加，骨生成減少，骨穩(wěn)態(tài)被破壞。自噬是維持細胞穩(wěn)態(tài)的重要機制[6]。有研究顯示，自噬參與調(diào)節(jié)OP的病理過程，對維持骨穩(wěn)態(tài)具有重要意義[7]。細胞中充當能量傳感器的AMP依賴蛋白激酶(AMPK)可調(diào)節(jié)自噬水平[8]，其下游分子mTOR激酶是自噬過程中的關鍵分子，AMPK通過磷酸化mTORC1的調(diào)控元件或磷酸化TSC2蛋白兩種途徑抑制mTOR信號通路，故AMPK的活化，可抑制mTOR活性，進而解除mTOR對自噬的抑制作用，促進細胞活性，調(diào)節(jié)骨形成[9]。有研究[10]發(fā)現(xiàn)，抑制自噬相關蛋白Atg5后，OB的增殖和分化亦受到抑制。且敲除OB中Atg7，可降低骨自噬水平，引起內(nèi)質網(wǎng)應激，ALP、Runx2等成骨分化標志物表達降低，骨基質礦化減少，細胞凋亡增加。以上研究均表明自噬有助于維持成骨細胞穩(wěn)態(tài)。

目前，臨床治療OP的藥物致癌、致畸、骨壞死等不良反應極大[11]。中藥相對安全、不良反應少，且多種有效成分進行配伍后可多靶點調(diào)節(jié)。課題組前期通過4次臨床研究發(fā)現(xiàn)，抗疏健骨顆?？娠@著提高OP臨床療效[12-13]。本研究通過摘除大鼠雙側卵巢，復制絕經(jīng)后OP模型，用不同劑量抗疏健骨顆粒進行干預后，檢測成骨、破骨標志物及自噬相關蛋白，闡明抗疏健骨顆粒改善OP與調(diào)節(jié)自噬水平的關系。該機制的闡明對深入認識OP發(fā)生機理，臨床運用抗疏健骨顆粒治療OP提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物及藥物

60只雌性SPF級SD大鼠，3～4月齡，體重180～220 g，購于空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心。實驗動物合格證明：SCXK(陜)2019-001。本研究經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學倫理委員會批準。

抗疏健骨顆粒由陜西省中藥基礎與新藥研究實驗室制備，高溫封瓶(1 g顆粒劑相當于10.15 g生藥)，4 ℃保存?zhèn)溆?，用時采用蒸餾水稀釋成不同濃度用于實驗。配方為：淫羊藿15 g、杜仲12 g、牛膝12 g、白術20 g、丹參10 g。

1.2 主要試劑

大鼠G蛋白偶聯(lián)受體48(GPR48)ELISA試劑盒(BG公司)，大鼠轉錄激活因子4(ATF4)ELISA試劑盒(AMEKO公司)，ALP、BGP和TRACP試劑盒(Abcom 公司)，AMPK、LC3-II、Beclin-1和P62抗體(Pierce 公司)，β-actin抗體、DAB、BCA試劑盒和辣根酶標記二抗(上海如吉生物科技公司)。

1.3 主要儀器及設備

平行電泳儀(Eps 100，Tanon公司)，半干轉儀(Tans-biot SD Cell，Bio-RAD)，凝膠成像系統(tǒng)(Universal Hood Ⅱ，Bio-RAD)，凝膠分析系統(tǒng)(GZS-2010，Tanon)，全波段酶標儀(M200 PRO，TECAN公司)，KHF-524組織切片機(德國萊卡公司)，DM4000B生物顯微鏡(日本Olympus公司)，自動恒溫攤烤烘片機(GTK-2002、西安瑞豐)，制冰機(BL20，Barline)，石蠟切片機(RM2015，Leica)。

1.4 動物分組與骨質疏松模型的建立

60只大鼠適應性喂養(yǎng)1周后按體重隨機分為5組(12只/組)，即假手術組、模型組、抗疏健骨顆粒低、中、高干預組。用10 %水合氯醛進行麻醉后，對大鼠進行雙側卵巢摘除術，復制絕經(jīng)后骨質疏松模型。其中假手術組找到左右大網(wǎng)膜后，選取與雙側卵巢重量相近的大網(wǎng)膜進行切除，剩余處置完全與其他各組相同，1周后拆線。手術12周后，隨機抽取模型組大鼠分離股骨，病理切片顯示有骨質疏松癥病理改變后，進行后續(xù)的藥物干預研究。動物飼養(yǎng)為12 h明/12 h暗交替，(22±2) ℃常溫正常飼養(yǎng)于籠中，自由飲食。

1.5 實驗動物給藥

參考《中藥藥理研究方法學》[14]，根據(jù)人和大鼠的計量折算系數(shù)確定所給藥量。其中，假手術組和模型組給予蒸餾水灌胃；抗疏健骨顆粒三個劑量組分別為：低[0.287 g/(kg·d)]、中[0.573 g/(kg·d)]和高[1.146 g/(kg·d)]。每日清晨經(jīng)口灌胃給藥，6次/周，共12周。實驗過程中每周稱重調(diào)整灌胃劑量。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1組織形態(tài)學檢測：隨機選取假手術組、模型組大鼠6只，每只大鼠制作3張病理切片。具體為剔除大鼠右側股骨肌肉及筋膜，保留骨膜。取股骨遠端，置于10 %福爾馬林固定液24 h，再將其置于10 %EDTA脫鈣液，每日更換脫鈣液，直至大頭針可輕輕刺入，HE染色后，光鏡下觀察組織結構改變情況。

1.6.2血清學檢測：給藥12周后，各組動物禁食12 h，注射10 %水合氯醛(0.4 mL/100 g)進行麻醉，腹主動脈采血，4 ℃下1 500 r/min離心5 min，制備血清，采用ELLSA法按說明書規(guī)范檢測骨鈣素(BGP)、堿性磷酸酶(ALP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)水平。

1.6.3股骨破骨、成骨水平檢測：采用ELLSA法，嚴格按照說明書測定骨組織中G蛋白偶聯(lián)受體-48(GPR48)、轉錄激活因子4(ATF4)含量表達情況。

1.6.4自噬相關蛋白檢測：用Western blotting法檢測股骨中自噬上游分子AMPK、自噬相關蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1和p62蛋白表達情況。取事先備好的股骨碎片200 mg，在含有液氮的研缽中充分研磨至粉末，小心收集骨粉末入勻漿管內(nèi)，加入2 mL預冷裂解液(RIPA裂解液∶抑制劑∶PMSF=100∶1∶1)，待組織完全裂解后，勻漿兩次，將勻漿液轉至離心管，冰上沉淀30 min后離心 (3 000 r/min，25 min)。取勻漿上清液入EP管，其中吸出20 μL上清液用于BCA蛋白定量(BCA工作液A∶B=50∶1)，剩余部分加入Loading Buffer，100 ℃煮沸8 min后放至室溫，轉入-80 ℃冰箱用于WB測定。WB檢測的具體步驟為：配膠→電泳→轉膜→封閉→孵一抗→洗膜、孵二抗→洗膜、發(fā)光。具體條件：濕式電泳儀轉膜300 mA、60 min；5 %脫脂牛奶室溫下封閉1 h；Ⅰ抗和內(nèi)參4 ℃孵育16 h；二抗(抗兔IgG)室溫下孵育1 h，ECL顯影。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 組織形態(tài)學檢測

采用HE染色檢測骨質疏松模型建立情況。假手術組骨髓腔較小，骨小梁數(shù)量較多且粗壯，形態(tài)結構完整，骨小梁有成骨細胞排列。模型組骨髓腔增大，骨小梁變細出現(xiàn)斷裂，數(shù)量減少、結構紊亂且不完整，骨外膜少見骨原細胞。如圖1。

圖1 假手術組與模型組HE染色鑒定骨質疏松模型構建情況假手術組(×4)假手術組(×40)；模型組(×4) 模型組 (×40)Fig.1 Assessment the osteoporosis models of the ovariectomy in Sham and Model groups

2.2 各組大鼠血清中ALP含量比較

與假手術組相比，模型組血清ALP明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；三個用藥組與模型組相比，ALP水平下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中，中劑量組ALP水平最低(P<0.05)，結果見表1。

表1 各組大鼠血清中ALP含量比較

2.3 各組大鼠血清中BGP、TRACP水平比較

與假手術組相比，模型組血清中BGP、TRACP水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，抗疏健骨顆粒三個劑量組均可以降低血清中BGP、TRACP水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而中劑量組對兩個指標降低的平均值最小。結果見表2。

表2 各組大鼠血清BGP、TRACP水平的比較

2.4 各組大鼠股骨GPR48、ATF4含量比較

與假手術組相比，模型組骨組織中GPR48和ATF4均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，抗疏健骨顆粒三個劑量組均可以升高骨GPR48和ATF4含量，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且GPR48高劑量組升高值最大，而ATF4低劑量組升高最多，結果見表3。

表3 各組大鼠骨組織GPR48、ATF4含量比較

2.5 各組骨組織AMPK蛋白的比較

與假手術組對比，模型組大鼠骨組織p-AMPK與t-AMPK比值下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，低、中、高三個劑量組均可升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，結果如圖2。mTOR上游蛋白AMPK表達狀況，發(fā)現(xiàn)抗疏健骨顆粒可提高AMPK磷酸化水平(圖4)，激活AMPK。

注：A 假手術組，B 模型組，C 低劑量治療組，D 中劑量治療組，E 高劑量治療組。*P<0.05。圖2 抗疏健骨顆粒對股骨AMPK的影響Fig.2 The effect of Kangshujiangu Granules on femoral AMPK

注：A 假手術組，B 模型組，C 低劑量治療組，D 中劑量治療組，E 高劑量治療組。* P<0.05。圖3 抗疏健骨顆粒對自噬相關蛋白的作用Fig.3 The effect of Kangshujian Granules on autophagy-related proteins in Femur tissues

2.6 各組骨組織自噬相關蛋白的比較

與假手術組對比，模型組大鼠骨組織LC3-Ⅱ、Beclin1的相對灰度值下降，P62相對灰度值升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，低、中、高三個藥物劑量組LC3-Ⅱ、Beclin1的相對灰度值升高，P62相對灰度值下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，結果如圖3。

3 討論

OP是骨形成與骨吸收的動態(tài)平衡被打破而發(fā)生。絕經(jīng)后骨質疏松癥是最常見的OP。自噬可調(diào)控骨骼穩(wěn)態(tài)。一旦自噬異常，會導致受損分子和細胞器過度積累，誘發(fā)一些疾病，包括OP[15]。

目前，臨床治療OP的主要策略是降低骨吸收或促進骨形成，但使用的藥物往往伴有明顯的不良反應。如被廣為使用的雙膦酸鹽類藥物可出現(xiàn)非典型股骨頭骨折和下頜骨壞死兩種嚴重并發(fā)癥[16]。雌激素和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑可顯著降低脊椎、非脊椎和髖部骨折，但可明顯引起乳腺癌、冠狀動脈和腦血管的血栓形成。因此，亟需尋找安全性高、療效廣泛的治療OP的臨床藥物。中醫(yī)學把骨質疏松歸為“骨枯”、“骨痿”、“骨痹”范疇，認為腎虛是骨質疏松的主要病機，脾虛是骨質疏松的重要因素，血瘀是骨質疏松的加重或促進因素?，F(xiàn)代中醫(yī)藥治療OP，有單味中藥、中藥復方和針灸推拿等多種方式[17]?？故杞」穷w粒是在總結臨床經(jīng)驗方基礎上，結合藥學實驗研發(fā)而成，主要功能是補腎健脾、活血壯骨。主要成分為淫羊藿、杜仲、牛膝、白術和丹參5味中藥。

摘除卵巢法建立OP模型與成年女性OP臨床癥狀高度相似，是公認的OP模型[20]。本研究中模型組股骨病理切片較假手術組骨髓腔變大，骨小梁變細并出現(xiàn)斷裂，表明此動物模型建立成功。骨代謝標志物可體現(xiàn)骨形成與骨吸收之間骨代謝的特點與水平，是評估骨質量的關鍵指標。ALP升高是OP發(fā)生的重要指標[18]。本研究結果與以往研究一致，模型組ALP值升高，抗疏健骨顆粒三個用藥組可降低ALP水平，從動物學角度證明抗疏健骨顆粒對改善OP具有一定作用。骨鈣素(BGP)由成骨細胞(OB)分泌產(chǎn)生，反映OB活性，是骨形成的特異性指標。本研究顯示，模型組BGP顯著高于假手術組和抗疏健骨顆粒三個用藥組，說明絕經(jīng)后OP是高轉換型，骨更新率快，且抗疏健骨顆?？赡芡ㄟ^改善OB功能，達到治療OP的作用。血清中TRACP是骨吸收和破骨細胞活性的良好標志物，OP時往往升高[19]。本研究顯示，模型組TRACP水平顯著高于假手術組，三個用藥組較模型組平均值有所降低，說明抗疏健骨顆粒可能作用于破骨細胞(OC)，但下降平均值僅為1.7 pg/L，是否具有現(xiàn)實臨床意義尚有待進一步研究。

GPR48可調(diào)節(jié)下游信號ATF4基因的表達，ATF4在成骨細胞分化和發(fā)育過程中是一個關鍵的轉錄因子。ATF4缺陷鼠表現(xiàn)出科勒綜合征(CLS)的骨骼表現(xiàn)型，即身材矮小、骨齡延遲、囟門閉合延遲、骨量減少、牙發(fā)育異常。成骨細胞蛋白合成能力下降，Ⅰ型膠原合成減少[20]。本研究結果顯示，模型組GPR48和ATF4含量顯著低于假手術組，而抗疏健骨顆粒三個劑量組均可升高GPR48和ATF4水平。說明抗疏健骨顆粒能夠在一定程上改善GPR48和ATF4相關信號的轉導過程，扭轉OP引起的骨代謝失衡，也進一步證明中醫(yī)補腎之法可以改變OP的內(nèi)在生物學病理變化。

AMPK是一種進化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在分解代謝上調(diào)和合成代謝失活中起關鍵作用?；罨腁MPK調(diào)節(jié)多種代謝過程，特別是自噬。故我們測定了股骨中AMPK及其下游的自噬相關蛋白水平，結果顯示，與假手術組對比，模型組大鼠骨組織p-AMPK與t-AMPK比值下降，而抗疏健骨顆?？缮哌@一比值，提示抗疏健骨顆?？赡芡ㄟ^調(diào)節(jié)AMPK，進而影響自噬，達到治療OP的作用。這一提示通過測定股骨中自噬標志蛋白Beclin1、LC3-II和P62水平得到驗證，結果顯示，模型組大鼠股骨中的Beclin1和LC3-Ⅱ的相對灰度值較假手術組下降，而P62相對灰度值升高，差異均有統(tǒng)計學意義；而與模型組相比，低、中、高三個藥物劑量組均可升高LC3-Ⅱ和Beclin1水平，降低P62含量，差異有統(tǒng)計學意義。這進一步證明抗疏健骨顆?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)自噬水平，改善OP癥狀。

綜上，抗疏健骨顆?？烧{(diào)節(jié)去卵巢骨質疏松大鼠血清及骨組織中骨代謝水平；增加AMPK磷酸化水平，加強AMPK對下游因子mTOR的抑制作用，使mTOR對自噬的抑制作用減輕，骨組織自噬水平增加，促進骨生成，進而調(diào)解骨穩(wěn)態(tài)，這可能是抗疏健骨顆粒治療OP的主要機制。