丙氨瑞林對(duì)子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)及FHIT表達(dá)的影響

杜麗英 張三元

[摘要] 目的 觀察醋酸丙氨瑞林對(duì)子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用及可能的作用機(jī)制。 方法 將HEC-1-B細(xì)胞注入裸鼠左前肢近腋窩處皮下，選24只雌性荷瘤裸鼠隨機(jī)分為4組，即低劑量組（18 μg/kg）、中劑量組（36 μg/kg）、高劑量組（72 μg/kg）和空白對(duì)照組（0 μg/kg），采取肌肉注射方式給藥4周。將瘤體完整取出，測(cè)量體積、繪制生長(zhǎng)曲線、計(jì)算抑瘤率，并用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)瘤組織中FHIT蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 ①隨著醋酸丙氨瑞林濃度由低到高，癌細(xì)胞受抑制漸趨明顯，低、中、高劑量組抑瘤率分別為17.0%、24.1%、42.1%，且與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。②免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，各干預(yù)組的FHIT蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高，且組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。 結(jié)論 醋酸丙氨瑞林對(duì)子宮內(nèi)膜癌皮下移植瘤生長(zhǎng)有抑制作用，且呈劑量依賴關(guān)系，其機(jī)制可能與上調(diào)FHIT蛋白表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 子宮內(nèi)膜癌；丙氨瑞林；移植瘤

[中圖分類號(hào)] R737.33[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1673-9701（2012）12-0006-03

子宮內(nèi)膜癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害著女性的健康。近年來(lái)隨著對(duì)促性腺激素類似物GnRH-a研究的不斷深入及臨床工作者追求低毒高效安全的腫瘤內(nèi)分泌治療方法熱情的不斷高漲，使其在治療子宮內(nèi)膜癌方面越來(lái)越受到人們的青睞。GnRH-a是人工合成的促性腺激素，文獻(xiàn)報(bào)道[1，2]其對(duì)子宮內(nèi)膜癌的治療已取得一定的效果。本研究通過(guò)不同劑量國(guó)產(chǎn)GnRH-a醋酸丙氨瑞林對(duì)裸鼠人子宮內(nèi)膜癌移植瘤的生長(zhǎng)及FHIT蛋白表達(dá)的影響，探討其對(duì)子宮內(nèi)膜癌的治療作用及可能的機(jī)制，為GnRH-a在子宮內(nèi)膜癌臨床治療方面提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞株，BALB/c雌性裸小鼠26只，醋酸丙氨瑞林，兔抗人FHIT多克隆抗體，免疫組織化學(xué)PV試劑盒。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1-B培養(yǎng)于10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，溫度37℃，pH 7.2，相對(duì)飽和濕度為40%～60%，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合時(shí)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制備成濃度為3.0×106/mL的單細(xì)胞懸液備用。

1.3 制備人子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤模型及生長(zhǎng)檢測(cè)

于裸鼠左前肢近腋窩處皮下注射子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1-B細(xì)胞懸液0.2 mL（約含6×106個(gè)細(xì)胞）后觀察：當(dāng)瘤體直徑約0.3～0.5 cm時(shí)將瘤體最大和最小的兩只裸鼠舍去，剩余的隨機(jī)分成4組，分別給予18 μg/kg、36 μg/kg、72 μg/kg醋酸丙氨瑞林及生理鹽水背部肌肉注射，1次/d，共4周。每4天測(cè)量1次瘤體的長(zhǎng)徑a和短徑b，計(jì)算其體積（mm3）=a×b2×0.52。實(shí)驗(yàn)后計(jì)算抑瘤率（IR%）=[1-治療組平均腫瘤體積/對(duì)照組平均腫瘤體積]×100%。抑瘤率＞15%為藥敏陽(yáng)性。

1.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)FHIT蛋白在移植瘤中的表達(dá)

將瘤體標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定、石蠟包埋，制成4 μm左右切片，免疫組化染色后脫蠟浸水；熱修復(fù)2 min，3% H2O2室溫孵育滅活內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶；滴加兔抗人FHIT多克隆抗體（1∶75），4℃濕盒過(guò)夜；加二抗，PBS浸洗后DAB顯色，最后蘇木素襯染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片、顯微鏡觀察。陰性對(duì)照組用PBS代替一抗。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：免疫組織染色后，F(xiàn)HIT蛋白在移植瘤中的陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色或棕褐色顆粒，主要定位于胞漿內(nèi)，少部分定位于胞核。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不連續(xù)、不重復(fù)的高倍視野（×400），用病理圖像分析軟件分析各切片陽(yáng)性產(chǎn)物的灰度值，取均數(shù)后行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以（x±s）表示，采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠移植瘤的形成及受不同干預(yù)后瘤體變化情況

接種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞懸液后，局部稍發(fā)紅、腫脹，后出現(xiàn)圓形或橢圓形的瘤體逐漸增大，且邊界清楚，質(zhì)由軟變硬，活動(dòng)較好。裸鼠逐漸出現(xiàn)消瘦，反應(yīng)力、活動(dòng)力下降等癥狀。對(duì)照組腫瘤體積增長(zhǎng)較快，其余各組均受到不同程度的抑制，而且隨著劑量的增加移植瘤生長(zhǎng)明顯減慢。

2.2 繪制體積變化曲線（圖1）

可見(jiàn)各組腫瘤生長(zhǎng)曲線斜率不同，斜率越小，腫瘤生長(zhǎng)速度受抑制越明顯，各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。同時(shí)可以看出干預(yù)組較對(duì)照組瘤體積均較小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），各組瘤體也隨劑量增加而明顯減小，且呈劑量依賴性。低、中、高劑量干預(yù)組的抑瘤率分別為17.0%、24.1%、42.1%，且組與組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 醋酸丙氨瑞林對(duì)子宮內(nèi)膜癌移植瘤中FHIT蛋白表達(dá)的影響

隨著丙氨瑞林劑量的增加，F(xiàn)HIT蛋白陽(yáng)性染色逐漸加深。對(duì)各切片陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行灰度值分析（表2）發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組比較，各治療組中FHIT蛋白表達(dá)水平灰度值均明顯降低（P ＜ 0.05），且不同劑量組間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。

3 討論

近年來(lái)，隨著對(duì)GnRH及其類似物研究的盛行，以及內(nèi)分泌治療在治療腫瘤中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，使GnRH及其類似物在治療子宮內(nèi)膜癌方面也越來(lái)越受到人們的關(guān)注。GnRH-a的作用機(jī)制可能是直接作用于腫瘤，也可能通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等間接起到抗腫瘤的作用，但其具體分子機(jī)制仍不十分清楚。近來(lái)有很多關(guān)于用GnRH-a成功治療復(fù)發(fā)或進(jìn)展期子宮內(nèi)膜癌的報(bào)道[3]，且沒(méi)有臨床數(shù)據(jù)顯示有副作用。Wang CB等[4]隨訪的年輕子宮內(nèi)膜癌患者中，應(yīng)用亮丙瑞林聯(lián)合甲地孕酮、他莫西芬的緩解率較不聯(lián)合亮丙瑞林治療的緩解率高。此外，也有研究報(bào)道，晚期子宮內(nèi)膜癌經(jīng)GnRH-a治療，可以得到很好的緩解，且耐受性好、毒性低。FHIT（脆性組氨酸三聯(lián)體基因）蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因[5]，屬于組氨酸三聯(lián)體蛋白家族，具有抑癌活性，一方面可以促進(jìn)微管的裝配，另一方面抑制細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。FHIT有1個(gè)專門與微球蛋白結(jié)合的位點(diǎn)，可促使微管集中，限制微管動(dòng)態(tài)活動(dòng)或干擾微管分散而阻止細(xì)胞的有絲分裂過(guò)程，抑制細(xì)胞過(guò)度增殖，使細(xì)胞受阻于增殖周期的S期，并激活Caspase28、Caspase29，引起Caspase酶介導(dǎo)的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[6]。Su TH及Ozaki K等[7，8]都證明了FHIT 基因的失活與子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

本研究選用免疫缺陷的裸鼠接種HEC-1B細(xì)胞株進(jìn)行造模以觀察醋酸丙氨瑞林的抗子宮內(nèi)膜癌作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌皮下移植瘤的生長(zhǎng)受到丙氨瑞林的抑制，呈劑量依賴性。劑量越大，腫瘤生長(zhǎng)受抑制程度越深。免疫組化法對(duì)胞質(zhì)中的FHIT蛋白活性檢測(cè)顯示隨著醋酸丙氨瑞林劑量的升高，F(xiàn)HIT的蛋白活性表達(dá)升高，顯示醋酸丙氨瑞林抑制子宮內(nèi)膜癌移植瘤生長(zhǎng)的作用機(jī)制可能通過(guò)上調(diào)FHIT蛋白的活性，激活Caspase28、Caspase29，引起Caspase酶介導(dǎo)的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上所述，GnRH及其類似物在一定程度上可以抑制子宮內(nèi)膜癌的生長(zhǎng)，其可能作為子宮內(nèi)膜癌內(nèi)分泌治療的一種有效藥物來(lái)應(yīng)用，因此展示在腫瘤患者面前的將是一個(gè)廣闊的前景。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Gallagher CJ，Oliver RT，Oram DH，et al. A new treatment for endometrial cancer with gonadotrophin releasing-hormone[J]. Br J Obstet Gynaecol，1991，98（10）：1037-1041.

[2]張玉泉，曹斌融，周先榮，等. 丙氨瑞林治療子宮內(nèi)膜癌后性激素及有絲分裂指數(shù)的變化[J]. 新藥與臨床，1996，15（4）：1942-1961.

[3]Grundker C，Gunthert AR，Westphalen S，et al. Biology of the gonadotrophin-releasing hormone system in gynecological cancers[J]. Eur J Endocrinol，2002，146（1）：1-14.

[4]Wang CB，Wang CJ，Huang HJ，et al. Fertility-preserving treatment in young patients with endometrial adenocarcinoma[J]. Cancer，2002，94（8）：2192-2198.

[5]Segawa T，Sasagawa T，Saijoh K，et al． Clinicopathological significance of fragile histidine triad transcription protein expression in endometrial carcinomas[J]. Clin Cancer Res，2000，6（6）：2341-2348.

[6]Ishii H，Dumon KR，Vecchione A，et al. Effect of adenoviral transduction of the fragile histidine trad gene into esophageal cancer cells[J]. Cancer Res，2001，61（4）：1578-1584.

[7]Su TH，Wang JC，Tseng HH，et al. Analysis of FHIT transcripts in cervical and endometrial cancers[J]. Int J Cancer，1998，76（2）：216-222.

[8]Ozaki K，Enomoto T，Yoshino K，et al. FHIT alterations in endometrial carcinoma and hyperplasia[J]. Int J Cancer，2000，85（3）：306-312.

（收稿日期：2012-02-02）